Revista RG News Vol. 8 N°2 2022

Revista RG News

Publicação eletrônica oficial da Sociedade Brasileira de Recursos Genéticos

COMISSÃO EDITORIAL DA REVISTA

Editor Chefe

Fernanda Vidigal Duarte Souza Editores Convidados

Alone Lima Brito

Andressa Priscila Piancó Santos Lima Claudinéia Regina Pelacani Cruz Marilza Neves do Nascimento Ribeiro

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Vice-Diretora de Eventos - Ana Cecília Ribeiro de Castro

Secretário Executivo - Everton Hilo de Souza

Revista de Recursos Genéticos - RG News

Brasília, DF

V.8 (2) 128p. 2022

ISSN 2526-8074

Sociedade Brasileira de Recursos Genéticos

FOTOS CAPA

Maria Nazaré Guimarães Marchi

Lenaldo Muniz de Oliveira

Romeu da Silva Leite

Clayton Queiroz Alves e Danielle Figuerêdo

Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais

A eventual citação de produtos e marcas comerciais não expressa, necessariamente, recomendações de seu uso pela SBRG.

É permitida a reprodução parcial, desde que citada a fonte.

"Os autores são os únicos responsáveis pelo conteúdo dos seus textos, não sendo necessariamente a mesma visão ou opinião da Revista e nem da Sociedade."

Editada pela SBRG

Sumário

I - Palavra dos Editores ……………………………………………………………………………………………….. 4

II - Banco de Germoplasma

Banco de Germoplasma de Forrageiras da Universidade Estadual de Feira de Santana (BGF-UEFS) ........................................................................................................................................................................................ 5

III - Artigos Científicos

Atividade biológica e toxicidade frente à Artemia salina do acesso BGP 152 de Passiflora suberosa L....................16 Avaliação in vitro do potencial biológico da espécie Passiflora suberosa L............................................................... 24

Caracterização química e estudo biomonitorado de extratos de Polygala boliviensis A.W. Benn (Polygalaceae)...... 32

Chemical analysis and evaluation of antioxidant, antiacetylcholinesterase activity and Artemia salina lethality by Asemeia ovata (Polygalaceae) ..................................................................................................................................... 44

Conservação e domesticação de Lippia Linn. (Verbenaceae): a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana ......................................................................................................................................................................... 51

Controle de qualidade e avaliação da atividade antimicrobiana in vitro de amostras comerciais do óleo essencial de Mentha piperita L. sobre E. coli .................................................................................................................................61

Correlação entre composição química de folhas de Zanthoxylum caribaeum Lam (Rutaceae) e atividade antioxidante ....................................................................................................................................................................................... 69

Estudo das linhas de pesquisa e caracterização agronômica de Physalis angulata L................................................... 81

Germinação in vitro de espécies de cactáceas nativas da Bahia com potencial ornamental ....................................... 92 Isolamento e identificação de metabólitos secundários de Polygala boliviensis A.W.Benn (Polygalaceae) …...…..102

Morfogênese in vitro de duas espécies de orquídeas da Chapada Diamantina-BA ....................................................110

Potencial ornamental de Jatropha L. (Euphorbiaceae) no estado da Bahia, Brasil ................................................... 119

Conservação e domesticação de Hyptidinae (Lamiaceae): a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana........................................................................................................................................................................ 129

Triagem fitoquímica de Myracrodruon urundeuva Fr. All sob diferentes cultivos.................................................... 140

I – Palavra dos Editores

Alone Lima Brito, Andressa Priscila Piancó Santos Lima, Claudinéia Regina Pelacani Cruz e Marilza Neves do Nascimento Ribeiro

Eis que chegamos aos 15 anos do Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV), uma iniciativa que é fruto de uma gama de experiências acumuladas de diversos atores. Nascemos com o objetivo de desenvolver tecnologias que visam a identificação, caracterização, conservação, melhoramento e utilização sustentável de recursos genéticos vegetais do semiárido brasileiro.

Quando avaliamos essa primeira década e meia de existência, constatamos que não apenas esse objetivo principal foi alcançado, mas que outros também foram - e continuam sendo - confirmados. A contribuição do PPGRGV para a sociedade permanece significativa e é por isso que aceitamos o desafio de ficar à frente desta edição especial da RG News, por meio da qual apresentamos alguns resultados obtidos por docentes, discentes e egressos do programa.

No âmbito da linha de pesquisa “Biodiversidade, bioprospecção e manejo sustentável de plantas nativas e cultivadas” observamos que muitas espécies endêmicas e/ou medicinais nativas do Nordeste têm como característica a produção de compostos bioativos. As pesquisas já desenvolvidas têm demonstrado que muitos extratos possuem grande atividade biológica (imunomoduladora, antiparasitária, antimicrobiana, citotóxica e antioxidante), a exemplo dos gêneros Polygala e Passiflora. Logo, o papel desses extratos nos estudos que buscam por medicamentos mais seguros e eficazes ou seus usos como protótipos para novas drogas é fundamental.

Na linha de pesquisa “Coleta, caracterização e conservação de Recursos Genéticos Vegetais”, por sua vez, são apresentados resultados de diversos estudos relativos à produção de diagnósticos da composição e estado de conservação da biodiversidade no semiárido e de seus usos potenciais, partindo de expedições de coletas e de identificação taxonômica dos espécimes em diferentes áreas do semiárido, com resgate do conhecimento etnobiológico e etnofarmacológico de comunidades tradicionais. Nessa mesma linha, espécies medicinais nativas e endêmicas, a exemplo das pertencentes aos gêneros Lippia e Hyptis, têm sido alvo de estudos na área de caracterização morfológica, fitoquímica e molecular, o que tem contribuído para a preservação do germoplasma existente. O levantamento dessas informações, em conjunto, tem contribuído para estudos de conservação ex situ dos recursos genéticos, através da implementação de coleções de plantas e estudos na área de domesticação dessas espécies, especialmente com interesse medicinal e aromáticos, bem como o potencial ornamental das euforbiáceas e cactáceas.

Dessa forma, através dos estudos realizados neste Programa de Pós-graduação, esperamos contribuir positivamente com a Sociedade Brasileira de Recursos Genéticos, por meio da divulgação dos resultados obtidos nas nossas diversas áreas de atuação. Para finalizar, agradecemos a todos que, de forma direta ou indireta, participaram da construção desta edição especial. Deixamos aqui um agradecimento especial aos discentes, egressos, docentes, pessoal administrativo do PPGRGV e pareceristas externos que se dedicaram à avaliação dos trabalhos submetidos.

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II - Banco de

Germoplasma

Banco de Germoplasma de Forrageiras da Universidade Estadual de Feira de Santana (BGF-UEFS)

Resumo

Expedições de coleta para resgate deste germoplasma na Bahia foram iniciadas no ano de 2007, em cinco mesorregiões (Nordeste baiano, Centro Norte Baiano, Extremo Oeste Baiano e Vale São Franciscano da Bahia). Diante da diversidade existente associado ao resgate de germoplasma até o ano de 2019 foi possível representar quase todo o Semiárido baiano, resgatando assim, aproximadamente 350 acessos do gênero que deram origem ao Banco de Germoplasma de Forrageiras da Universidade Estadual de Feira de Santana (BGF-UEFS), onde as sementes são conservadas na forma ex-situ, sendo que deste total, já existem depositados no BGF-UEFS 220 amostras oriundas de multiplicação. Estudos preliminares associados às expedições de coleta, identificação botânica, caracterização e avaliação preliminar e aprofundada realizados por discentes do programa de Recursos Genéticos Vegetais puderam comprovar que a região apresenta elevada diversidade de espécies, bem como ecótipos com grande variabilidade genética para vários descritores de importância econômica que podem ser utilizados para obter indivíduos superiores (cultivares) que venham atender a demanda de produtores do Semiárido brasileiro.

Palavras-Chave: BGF-UEFS; Stylosanthes spp.; situação atual; perspectivas

Abstract

(Forage germplasm bank of the State University of Feira de Santana (BGF-UEFS)). Collection expeditions for the rescue of this germplasm in Bahia began in 2007, in five mesoregions (Northeast of Bahia, Central North of Bahia, Far West of Bahia and Vale São Franciscano of Bahia). In view of the existing diversity associated with the rescue of germplasm, until the year 2019, it was possible to represent almost the entire Bahian Semiarid region, thus rescuing approximately 350 accessions of the genus that gave rise to the Forage Germplasm Bank of the State University of Feira de Santana (BGF-UEFS), where the seeds are conserved ex-situ, and of this total, there are already deposited in the BGFUEFS, 220 samples from multiplication. Preliminary studies associated with collection expeditions, botanical identification, characterization and preliminary and in-depth evaluation carried out by students of the Plant Genetic Resources program proved that the region has a high diversity of species, as well as ecotypes with great genetic variability for several descriptors of economic importance that can be used to obtain superior individuals (cultivars) that will meet the demand of producers in the Brazilian semiarid region.

Keywords: BGF-UEFS; Stylosanthes spp; current situation; perspectives.

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1

Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: sergioromulo.alves1@gmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: aritana.agronomia@gmail.com

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: crpcruz@uefs.br

Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: vitor.agro.uefs@gmail.com

5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: simao_mascarenhas@gmail.com

6 Unesp Campus Botucatu, Av. Prof. Montenegro, s/n, 18618-687, Botucatu, SP, Brasil. E-mail: danilo.gissi@unesp.br

IF Baiano Campus Xique-Xique, Rodovia Ba 052, Km 458, s/n, 47400-000, Xique-Xique, BA, Brasil. E-mail: ronaldosimaorso@gmail.com

Introdução

A Agricultura surgiu no período Neolítico, há cerca de 10.000 anos atrás e este foi considerado o momento que o homem passou a cultivar as plantas e criar animais, transformando os ecossistemas naturais originais em ecossistemas cultivados. O estudo com os RGVs iniciou-se com o botânico suíço ALPHONSE DE CANDOLLE (1885), onde ele reconheceu que as informações arqueológicas, botânicas e geográficas eram importantes para compreender a origem da agricultura. Posteriormente, o botânico Nicolai Vavilov baseado nos estudos de De Candole introduzindo os estudos genéticos formulou hipóteses para explicar o surgimento da agricultura e a proposição de formação dos centros de domesticação das plantas cultivadas (SERENO; WIETHÖLTER; TERRA, 2008).

Desta forma, Vavilov foi o responsável pelas primeiras expedições para estudar e analisar a distribuição e diversidade das plantas cultivadas. Ao longo do século XX, o aumento da produção agrícola se deu, principalmente na forma de monocultivos. Associado a isso, a Segunda Grande Guerra Mundial foi o ponto inicial para desenvolver a consciência do perigo de erosão genética. No entanto, na década de 30, a perda dos recursos genéticos vegetais já era denunciada e em 1936 já se usava a palavra germoplasma, para se referir à parte física do material hereditário passível de ser armazenado (HARLAN; MARTINI, 1936).

Em 1961 a divisão Produção e Proteção de Plantas da FAO, promoveu um encontro técnico, sobre exploração e introdução de plantas, do qual emergiu uma revisão da situação mundial e foram apresentadas sugestões e recomendações (FAO, 1967). Dentre outras recomendações foi sugerida a criação de centros em todo o mundo para reunir e estudar o germoplasma mundial e que a FAO organizasse a coordenação.

No Brasil, a conservação dos Recursos Genéticos foi iniciada em 1974 pela Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (CENARGEN), com o estabelecimento do Centro Nacional de Pesquisa em Recursos Genéticos, denominado atualmente como Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, com sede em Brasília (KNUDSEN, 2000). Os esforços da pesquisa agropecuária brasileira no acesso e uso dos recursos genéticos vegetais para adaptação de cultivos às mais variadas condições agroecológicas, juntamente com o desenvolvimento de inovações para a redução da acidez do solo, manejo da fertilidade, manejo sanitário e mecanização, tiveram papel marcante na expansão qualitativa e quantitativa observada na agricultura brasileira ao longo das últimas décadas (QUEIROZ; LOPES, 2007).

No Nordeste do Brasil, mais especificamente nos estudos envolvendo as regiões semiáridas, os esforços de conservação já são expressivos, pela formação dos BAGs e coleções de trabalho de fruteiras tropicais, oleáceas, forrageiras, grãos, fibrosas e oleaginosas (OLIVEIRA, 2015). A maior parte dos trabalhos de manejo de RGVs na Região Nordeste foram desenvolvidos a partir da década de 70, com uma quantidade elevada de germoplasma que foi resgatado e armazenado em diversas instituições de ensino e pesquisa (RAMOS et al.,2008) e hoje várias instituições da região se empenham em estudar os recursos genéticos existentes.

Especificamente, o Semiárido brasileiro tem uma flora bastante diversificada, contando com mais de 1000 espécies, das quais mais de 300 são endêmicas (GIULIETTI et al., 2004). As espécies nativas consumidas pelos animais são muitas, incluindo, além das gramíneas (Poaceae) e leguminosas (Caesalpinaceae, Fabaceae e Mimosaceae), espécies de várias outras famílias, embora não haja um levantamento completo para a caatinga. Mas, os dados existentes sobre as leguminosas da Bahia dão uma medida de sua variabilidade, chamando a atenção o fato de que esse potencial foi muito pouco estudado e tem sido mais fácil importar espécies do que selecionar e melhorar as plantas nativa. Dentre o germoplasma nativo estudado, encontra- se, o gênero Stylosanthes que já foi comprovado a elevada - ocorrência na região e estudos preliminares envolvendo as fases de caracterização e avaliação, indicam a possibilidade de selecionar individuos superiores, com boa adaptação aos diferentes ambientes e carcteres bromatológicos promissores que podem proporcionar ganho significativo de peso em animais, já que a Bahia apresenta 70% da criação de caprinos e ovinos do país.

Desta forma o presente trabalho objetivou apresentar a situação atual e as perspectivas de uso do germoplasma de Stylosanthes conservado no Banco de Germoplasma de Forrageiras da Universidade Estadual de Feira de Santana – BGFUEFS.

História do Banco

O BGF-UEFS originou-se da necessidade de se ampliar os estudos com os recursos genéticos, especificamente os recursos genéticos forrageiros nativos, iniciando-se pelo resgate de espécies pertencentes ao gênero Stylosanthes.

Assim, no Semiárido brasileiro, um dos centros de diversidade do gênero Stylosanthes spp., os estudos com este germoplasma iniciaram-se de forma aprofundada em 2007, onde a partir de uma parceria da Embrapa Semiárido, Universidade do Estado da Bahia (UNEB) e Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) sob a coordenação do Prof. Manoel Abílio de Queiróz, foi aprovado um projeto junto ao Banco do Nordeste, com o intuito de estudar e resgatar germoplasma forrageiro. Os trabalhos se iniciaram com o resgate de germoplasma do gênero Stylosanthes, dando origem a primeira coleção de Stylosanthes spp.com cerca de 100 acessos coletados em vários municípios das mesorregiões Sisaleira e São Franciscana. Estes acessos, inicialmente foram armazenados no Departamento de Tecnologia e Ciências Sócias, UNEB, em Juazeiro (QUEIROZ, 2011) e posteriormente foram estudados de forma aprofundada a partir de trabalho realizado no programa de Pós-Graduação em recursos genéticos Vegetais da UEFS.

Por meio do estudo de OLIVEIRA (2015) procurou-se identificaras instituições do Semiárido brasileiro que trabalhavam com forrageiras tropicais, a fim de realizar o levantamento dos pontos de ocorrência para direcionar novas expedições de coleta desse germoplasma, ampliando assim a representatividade do BGF-UEFS. Em posse dessas informações foram identificados os sítios de coleta com maior variabilidade e diferentes expedições foram realizadas. As coletas ocorreram em diferentes mesorregiões da Bahia, priorizando os locais de maior variabilidade genética. Durante as expedições, todos os pontos de coleta foram georreferenciados utilizando GPS com precisão de sete metros e as informações sobre a área foram catalogadas em caderneta de campo. Diante do elevado número de locais amostrados, observou-se que as coletas atenderam aos princípios de amostragem (WALTER; CAVALCANTI, 2005), onde foi possível amostrar o maior número de locais em relação ao número de plantas amostradas em cada local de coleta.

Foram coletados frutos/sementes para conservação e material vegetal para confecção das exsicatas. O material vegetal foi previamente prensado e depositado no herbário da UEFS e os frutos/sementes armazenados em sacos de papel para posterior beneficiamento, e inserção no BGF-UEFS (OLIVEIRA, 2015). Durante o período de 2011 até 2019 foram realizadas diferentes expedições, adotando-se como prioridade, aquelas regiões pertencentes ao Semiárido brasileiro.

Concomitantemente, trabalhos de conclusão de curso em Biologia e Engenharia Agronômica, diferentes dissertações e teses foram realizadas focando nas diferentes fases de estudo dos Recursos Genéticos Vegetais (coleta, caracterização preliminar, avaliação preliminar/aprofundada e uso). Todo o material conservado encontra-se armazenado em forma de sementes/frutos seguindo a metodologia de GOMEZ-CAMPO (2006), na Unidade Experimental Horto Florestal/UEFS.

Coleções que compõem o Banco

As expedições de campo, que tiveram início em 2007 e ocorreram até meados de 2019, possibilitaram a coleta de uma grande diversidade de material vegetal, que se encontra depositado no BGF-UEFS. Desta forma, o BGF-UEFS reúne uma importante diversidade genética de acessos de Stylosanthes spp., composto atualmente de 570 acessos, sendo que estes incluem 350 acessos oriundos das coletas originais e 220 acessos que já foram multiplicados em diferentes experimentos de laboratório e campo. Entre esses acessos encontram-se armazenadas duas cultivares (Cultivar Campo Grande e BRS Bela), que foram adquiridas em casa comercial nos anos de 2011 e 2018, respectivamente e servem de referência para os estudos e comparações em campo.

O levantamento preliminar dos dados, revelaram que os acessos mantidos no Banco de Germoplasma de Forrageiras (BGF-UEFS) pertencem a diferentes espécies do gênero Stylosanthes que representa diversas regiões da Bahia (Figura 1), confirmando a ideia inicial da proposta de que havia grande ocorrência e elevada variabilidade do gênero na região (OLIVEIRA; QUEIROZ, 2016).

Figura 1. Espacialização dos pontos de coleta de 225 acessos nas mesorregiões da Bahia.

De acordo com os dados mostrados na figura 1, pode-se observar os pontos de coleta onde foram resgatados os acessos nas mesorregiões do território baiano. Observou-se que 5 das 7 mesorregiões foram contempladas com expedições, sendo as seguintes mesorregiões: Vale São Franciscana (59), Centro Sul Baiano (24), Nordeste Baiano (61), Centro Norte Baiano (58) e Extremo Oeste Baiano (23), representando os 225 acessos coletados entre 2007 e 2014.

Contudo vale destacar que as expedições de coleta que ocorreram em 2019 não estão contempladas nessa figura 1. Essas coletas resgataram 125 acessos, que foram coletadas em cinco das sete mesorregiões que compõem o território baiano. O material advindo dessa nova coleta, ainda se encontra em processo de cadastramento no herbário, para posterior identificação das espécies. Vale ressaltar que a etapa de beneficiamento já foi realizada e os acessos estão conservados em vasos herméticos. Dos acessos coletados, 147 já foram identificados botanicamente até o momento (Tabela 1), observando-se a existência de nove espécies (S. capitata, S. gracilis, S. guianensis, S. humilis, S. macrocephala, S. pilosa, S. scabra, S. seabrana e S. viscosa), embora os materiais oriundos das últimas coletas encontram-se em fase de identificação, possivelmente o número de espécies ocorrentes no estado da Bahia pode aumentar.

Para os acessos identificados, houve maior representantes para as espécies: Stylosanthes scabra e S. guianensis Duas espécies que apresentam características de destaques para as regiões semiáridas, tendo em vista sua adaptação às condições edafoclimáticas, tolerante a seca e de grande variabilidade genética (ARAUJO, 2019; FERREIRA; COSTA, 1977) e, portanto, uma fonte valiosa de estudo a ser explorada.

Métodos de Conservação

O material é conservado de forma ex situ, ou seja, fora do habitat natural (COSTA; SPEHAR, 2012). Após os procedimentos de coletas os frutos foram armazenados em sacos de papel e identificados com o número do ponto de coleta do acesso e encaminhados ao Laboratório de Ecologia Evolutiva - LEE da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), nas coletas de 2008, e ao Laboratório de Germinação – LAGER da Unidade Experimental Horto Florestal pertencente a UEFS, nas coletas de 2014 e 2019. Em laboratório eles passaram por beneficiamento manual, que consistiu na remoção do lomento por meio de fricção utilizando emborrachados de 4 mm de espessura (Figura 2).

Tabela 1. Identificação Taxonômica dos acessos do BGF-UEFS

GÊNERO/ESPÉCIE QUANTITATIVO CIDADES

Stylosanthes capitata 12

CAMPO ALEGRE DE LOURDES (2) / MUQUÉM DO SÃO FRANCISCO (2) / SEABRA (2) / WAGNER (2) / BARREIRAS (1) / CRISTÓPOLIS (1) / FEIRA DE SANTANA (1) / IBOTIRAMA (1)

Stylosanthes gracilis 1 LUÍS EDUARDO MAGALHÃES (1)

Stylosanthes guianensis 11

LUÍS EDUARDO MAGALHÃES (5) / BARREIRAS (3) / CRISTÓPOLIS (2) / SEABRA (1)

Stylosanthes humilis 10 CASA NOVA (6) /SENTO SÉ (2) / FEIRA DE SANTANA (1) / JUAZEIRO (1)

Stylosanthes macrocephala 8

MORRO DO CHAPÉU (3) / FEIRA DE SANTANA (2) / CRISTÓPOLIS (1) / LUÍS EDUARDO MAGALHÃES (1) / MUQUÉM DO SÃO FRANSCISCO (1)

Stylosanthes pilosa 3 LUÍS EDUARDO MAGALHÃES (1) / SEABRA (1) / UTINGA (1)

Stylosanthes scabra 75

FEIRA DE SANTANA (12) /MORRO DO CHAPÉU (6) / QUEIMADAS (6) / SERRINHA (6) / VALENTE (5) / CANDEAL (4) / SEABRA (3) / TUCANO (3) / ARACI (2) / AMÉRICA DOURADA (2) / BONITO (2) / CANARANA (2) / CANSANÇÃO (2) / CRISTÓPOLIS (2) / ICHU (2) / NOVA SOURE (2) / RAFAEL JAMBEIRO (2) / SÃO DOMINGOS (2) SENTO SÉ (2) / VÁRZEA NOVA (2) / IBOTIRAMA (1) / MONTE SANTO (1) / SOBADINHO (1) / PALMEIRAS (1) / UTINGA (1) / WAGNER (1)

Stylosanthes seabrana 5 CAFARNAUM (1) / IBOTIRAMA (1) / MORRO DO CHAPÉU (1) / MULUNGU DO MORRO (1) / MUQUÉM DO SÃO FRANCISCO (1)

Stylosanthes viscosa 22

TOTAL 147

FEIRA DE SANTANA (4) /CASA NOVA (3) /ARACI (2) / CANUDOS (2) / ITABERABA (2) / LAJEDINHO (2) / SEABRA (2) / LENCÓIS (1) / MORRO DO CHAPÉU (1) / RAFAEL JAMBEIRO (1) / UTINGA (1)

As sementes obtidas de cada acesso foram alocadas em envelopes de papel do tipo kraft, etiquetados com identificação de três letras, ano de coleta e número de identificação do acesso (ex. BGF 08-001), fechados com grampo galvanizado e acondicionadas em vasos herméticos contendo sílica gel como indicador de umidade e mantidas em temperatura ambiente em torno de 26 ºC (GÓMEZ-CAMPO, 2006). Vale ressaltar que, para melhor manejo desse BAG, atualmente houve alteração na nomenclatura desatualizada, todas as informações disponíveis foram anotadas em planilhas do Excel e todos os acessos foram acondicionados em sacos de papel, identificados com etiqueta e distribuídos em vasos herméticos identificados e com a sílica gel trocada (Figura 3).

Figura 3. Etapas de organização do BGF-UEFS. Fonte dos dados: Os autores. A) situação de armazenamento das sementes de Stylosanthes; B) nomenclatura desatualizada; C) troca dos sacos de papel e etiquetagem com nomenclatura atualizada; e armazenamento das sementes e troca da sílica em gel.

De forma geral, a sequência de atividades adotadas no BGF-UEFS, após as expedições de coleta/multiplicação tem ocorrido da seguinte forma: 1 - recebimento dos acessos para incorporação no BAG – esta etapa ocorre com a conferência dos acessos coletados/multiplicados, por meio das cadernetas de campo; 2 – limpeza, homogeneização e contagem - ocorre o beneficiamento, com a retirada de todos os tecidos que recobrem as sementes em etapas muitas vezes morosas e complexas, utiliza-se peneiras e a fricção entre superfícies emborrachadas para a separação das sementes íntegras, etapa que a depender do volume e número de amostras coletadas e/ou multiplicadas torna-se de difícil execução e com elevada demanda de mão de obra (GÓMEZ-CAMPO, 2006; OLIVEIRA; QUEIROZ, 2016). Diante da simplicidade e eficiência, este procedimento tem sido adotado com a finalidade de reduzir custos. O germoplasma conservado passa por monitoração constante, observando-se sempre a coloração do indicador de umidade, (sílica gel), para que ocorra a substituição quando necessário, para que a eficiência do armazenamento não seja comprometida.

Entretanto, após essas etapas, a recomendação é avaliar o teor de umidade, a porcentagem de germinação e avaliações como a sanidade das sementes. Mas, nem sempre isso tem ocorrido em tempo hábil, em função da própria infraestrutura disponível, escassez de recursos financeiros operacionais e mão de obra disponível. Na maioria das vezes recorre-se a alocação das sementes dessecadas, ainda presa aos tecidos dos frutos nos envelopes de papel, porém SILVA (2021) avaliou que tais processos e análises não prejudicam a viabilidade das sementes, desde que as mesmas tenham sido coletadas no ponto de maturação ideal, conseguindo manter a conservação das sementes/frutos em médio prazo e permitirá a redução de tempo e mão de obra na etapa inicial de beneficiamento (SILVA, 2021).

Após o armazenamento do germoplasma, os acessos encontram-se acessíveis para sustentar as seguintes ações: identificação taxonômica das espécies para aqueles acessos que não foram herborizados; dados de caracterização morfológica; avaliações agronômicas; procedência do acesso; forma de obtenção e informações complementares adicionadas aos dados de passaporte.

Caracterização, avaliação e documentação

Foi realizado um levantamento de 100% nos acessos existentes no BGF-UEFS, o inventário foi realizado no final do mês de outubro de 2021, por meio do levantamento de todos os acessos coletados e depositados no BAG, através de uma busca nos dados de passaporte, de caracterização e avaliação dos acessos conservados. Associado a isso, existe uma parceria entre a UEFS e o Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia Baiano-campus Xique-Xique, que tem possibilitado o trabalho multi institucional, envolvendo diferentes especialistas (botânicos, fisiologistas, melhoristas, biólogos, agrônomos, especialistas em RGVs) e o mais importante, discentes de diferentes cursos (Técnicos em Agropecuária e Meio Ambiente, Biologia, Engenharia Agronômica e Farmácia) promovendo a troca de experiência e o intercâmbio de informações entre os diferentes níveis do ensino, fortalecendo o tripé Ensino-Pesquisa-Extensão e

cumprindo o papel social e científico de formar jovens pesquisadores e pesquisadores que têm atuado, tanto no setor privado, bem como no setor público, seja na academia, ou no mercado de trabalho.

Desta maneira, a formação deste BAG possibilitou aperfeiçoar recursos humanos nas áreas de Recursos Genéticos Vegetais e desenvolver pesquisas com estudantes de iniciação científica júnior, graduação e pós-graduação (Mestrado e Doutorado). Já foram desenvolvidos, quatro trabalhos de iniciação científica júnior, dois trabalhos de conclusão de curso (JESUS, G. S., 2021; PEREIRA, L. S., 2021), quatro trabalhos de mestrado (SANTANA, A. S., 2010; AMÉRICO, F. K., 2015; GONÇALVES-NETO, L. P., 2020; SILVA, A. A., 2021) e um de doutorado (OLIVEIRA, R. S., 2015) com o gênero Stylosanthes (Tabela 2).

Tabela 2. Trabalhos desenvolvidos com acessos de Stylosanthes spp. provenientes do BGF-UEFS. NÍVEL AUTOR ANO PESQUISA

DOUTORADO OLIVEIRA, R. S. 2015

Levantamento da ocorrência de espécies do gênero Stylosanthes e estudo de pré-melhoramento em acessos coletados no Semiárido baiano.

SANTANA, A. S. 2010 Resgate de populações naturais do gênero Stylosanthes. AMÉRICO, F. K. 2015

Condições adequadas de temperatura e substrato em testes de germinabilidade de sementes de S. capitata, S. scabra e S. viscosa

MESTRADO

GONÇALVES NETO, L. P. 2020

SILVA, A. A. 2021

Características fisiológicas, morfoagronômicas e qualidade de forragem de Stylosanthes sp. em diferentes condições de disponibilidade hídrica.

Avaliação fisiológica de sementes de Stylosanthes spp. armazenadas no BGF-UEFS

GRADUAÇÃO

PEREIRA, L. S. 2021 Viabilidade de sementes de Stylosanthes spp. JESUS, G. S. 2021

Fitotoxicidade do alumínio em diferentes genótipos de Stylosanthes

Os trabalhos de iniciação científica júnior têm sido desenvolvidos no campus do IF Baiano em Xique-Xique, onde os jovens pesquisadores são inseridos em diferentes projetos de coleta, caracterização e avaliação de germoplasma, pertencente ao BGF-UEFS.

O trabalho de SANTANA (2010) permitiu que fossem resgatadas populações naturais do gênero Stylosanthes, iniciando a formação do BGF-UEFS. Neste trabalho foram resgatados 81 acessos de Stylosanthes, em 91 pontos georreferenciados com auxílio do Sistema de Posicionamento Global (GPS), sendo que parte desses acessos coletados foram multiplicados e caracterizados morfometricamente.

AMÉRICO (2015) buscou estabelecer as condições adequadas de temperatura e substrato em testes de germinabilidade de sementes de S. capitata, S. scabra e S. viscosa provenientes de sementes coletadas em 2012, as quais foram multiplicadas para os estudos. Esta autora identificou que houve variabilidade entre as espécies, quanto às condições estabelecidas nos testes de germinabilidade, sendo recomendado para S. capitata o uso do substrato sobre papel nas temperaturas de 30 °C constante e 20-30 °C alternada e para S. scabra e S. viscosa deve- se utilizar o rolo de papel na temperatura de 25 °C constante.

Em 2015, OLIVEIRA (2015) organizou e concretizou a criação do Banco de Germoplasma de Forrageiras da Universidade Estadual de Feira de Santana, BA (BGF- UEFS), por meio da realização do levantamento da ocorrência de espécies do gênero Stylosanthes, além disso, o mesmo conduziu estudo de pré-melhoramento em uma amostra de 35 acessos coletados no Semiárido baiano entre os anos de 2008 e 2014, mais uma testemunha (Cultivar Campo Grande).

E mais recente, GONÇALVES NETO (2021) avaliou a características fisiológicas, morfoagronômicas e qualidade de forragem de Stylosanthes sp. em diferentes condições de disponibilidade hídrica. E SILVA (2021) avaliou a qualidade fisiológica de sementes que já se encontravam armazenadas no BAG em diferentes anos, além de avaliar a possibilidade de armazenamento das sementes ainda dentro do fruto. E PEREIRA (2021) e JESUS (2021) também contribuíram com as avaliações do BAG, com avaliação da viabilidade das sementes que já se encontram armazenadas no banco e com avaliação da fitoxicidade do alumínio em representantes do banco, respectivamente.

Vale ressaltar que o gênero Stylosanthes spp. é constituído por espécies herbáceas, com folhas trifolioladas, estípulas bidentadas com bainhas amplexicaules, inflorescências espiciformes com flores amarelas, compostas ou não de eixo rudimentar plumoso e frutos do tipo lomento, com um ou dois artículos com estiletes residuais (FERREIRA; COSTA, 1979). Toda essa variabilidade dentro e entre espécies desse gênero já foi observada nos acessos no BGF-UEFS (Figura 4).

Além disso, nota-se que para os acessos já avaliados existem representantes com superioridade para descritores importantes para a produção animal, como: relação folha/caule, produção de massa fresca e seca, teores nutricionais e resistência a estresses bióticos e abióticos (OLIVEIRA; QUEIRÓZ, 2016).

Uso potencial e inovação

A Bahia, ainda permanece com o baixo uso dos seus recursos genéticos vegetais disponíveis. Tal fato decorre de inúmeros fatores, podendo-se destacar a falta de recursos humanos para aprofundar os estudos em RGV’s emelhoramento vegetal, priorizando as fases de caracterização e avaliação aprofundada e uso desses materiais, a fim de gerar produtos (cultivares). Entretanto, mesmo com a escassez de recursos financeiros, os estudos atuais têm demonstrado a existência de acessos com potencial de uso imediato e genótipos com potencial de uso em programas de melhoramento para o gênero.

Assim, a ideia do BGF-UEFS é possibilitar o surgimento de cultivares melhoradas para as condições do Semiárido baiano, a fim de atender a demanda de produtores e contribuir para a diminuição da devastação da caatinga e geração de uma nova fonte de renda para as populações locais.

Perspectivas futuras/parcerias

A parceria entre as universidades públicas do estado – Universidade Estadual de Feira de Santana, BA (UEFS) e Universidade do Estado da Bahia, campus de Juazeiro, BA (UNEB-DTCS) -, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Baiano, campus Xique Xique, BA (IF Baiano) e a Embrapa Semiárido tem possibilitado a interação entre professores pesquisadores de diferentes subáreas das Ciências Agrárias como Recursos Genéticos Vegetais, Melhoramento Genético Vegetal, Forragicultura, Fisiologia Vegetal, Tecnologia de Sementes e também a inserção de alunos nível médio profissionalizante, de graduação , mestrado e doutorado, possibilitando a realização de estágios voluntários e de iniciação científica com as espécies armazenadas.

Segundo MORALES (1988), o germoplasma nunca deve ser considerado como material estático (peças de museu ou exsicatas de herbário). Com isso, a caracterização, multiplicação, regeneração, conservação, documentação, uso e enriquecimento de coleções ativas de germoplasma de espécies forrageiras, como o gênero Stylosanthes spp. é de suma importância dentro dos bancos de recursos genéticos vegetais, e principalmente para fomentar pesquisas futuras que tragam benefícios para a região Semiárida e formação continuada dos recursos humanos que estão associados a tais processos.

Curiosidades

O BGF-UES já conta com estudos de conservação, caracterização morfológica e agronômica, qualidade fisiológica, avaliação bromatológica, avaliação do desempenho dos acessos em diferentes ambientes (interação G x A), o que permite estruturado os caminhos que levará futuramente ao lançamento de uma cultivar adaptada a região Semiárida.

Agradecimentos

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) pelo apoio financeiro. Aos Professores Luciano Paganucci de Queiróz e Danilo Soares Gissi pela ajuda na identificação taxonômica dos acessos pertencentes ao BGF-UEFS.

Referências

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III - Artigos Científicos

Atividade

biológica e toxicidade frente à Artemia salina do acesso BGP 152 de Passiflora

suberosa L.

Glaucia L. P. L. Neco1, Anne R. Santana2, Danielle F. da Silva3, Diego M. da Costa4, Clayton Q. Alves5 , Hugo N. Brandão6 e Onildo N. Jesus7

Resumo

Os produtos naturais vêm revolucionando o tratamento de diversas patologias. As plantas medicinais têm sido ao longo dos anos o recurso mais empregado pelo homem no tratamento de enfermidades de todos os tipos. Diante desses dados e, sabendo da riqueza do gênero Passiflora devido a presença de metabólitos secundários bioativos, juntamente com relatos de diversas propriedades medicinais, faz-se indispensável à realização de pesquisas com diferentes espécies do gênero que avaliem a constituição química e atividades biológicas, como avaliação da inibição da acetilcolinesterase e letalidade frente à Artemia salina. Através da avaliação da atividade inibitória da Acetilcolinesterase, realizada pelo método de Ellman e colaboradores, foi possível verificar que o extrato clorofórmico (EC) apresentou baixa inibição, inferior a 30%, o extrato acetato de etila (EA) apresentou atividade moderada, com inibição de 33,56%, e os extratos bruto (EB) e hexânico (EH) não demonstraram atividade inibitória frente a enzima. Quanto à avaliação toxicológica, todo os extratos testados apresentaram toxicidade frente à Artemia salina nas concentrações de 1000, 500 e 100μg/mL. Em suma, esses resultados demonstram o potencial da espécie, sendo esse trabalho relevante para novos estudos com a espécie Passiflora suberosa.

Palavras-Chave: acetilcolinesterase; Artemia salina; fitoquímica; Passiflora suberosa; toxicidade.

Abstract

(Biological activity and toxicity against Artemia salina from the BGP 152 accession of Passiflora suberosa.). Natural products have revolutionized the treatment of various pathologies. Medicinal plants have been, over the years, the most used resource by man in the treatment of all kinds of diseases. In view of these data and, knowing the richness of the genus Passiflora due to the presence of bioactive secondary metabolites, together with reports of various medicinal properties, it is essential to carry out research with different species of the genus that evaluate the chemical constitution and biological activities, such as evaluation of acetylcholinesterase inhibition and lethality against Artemia salina Through the evaluation of the inhibitory activity of Acetylcholinesterase, carried out by the method of Ellman et al., it was possible to verify that the chloroform extract (EC) showed low inhibition, less than 30%, the ethyl acetate extract (EA) showed moderate activity, with inhibition of 33.56%, and the crude (EB) and hexane (EH) extracts did not demonstrate inhibitory activity against the enzyme. As for the toxicological evaluation, all the extracts tested showed toxicity against Artemia salina at concentrationsof1000,500and100μg/mL.Inshort,thisworkaimstoshowthediversity of metabolically active products produced by Passiflora suberosa, as well as their pharmacological potential.

Keywords: acetylcholinesterase; Artemia salina; phytochemistry; Passiflora suberosa; toxicity

Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: glaucialaisneco@hotmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: anneramosdesantana@gmail.com

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: dfsilva@uefs.br

4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: diegocost@live.com

5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cqalves@uefs.com

6 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.com

7 Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Rua Embrapa, s/n, 44380-000, Cruz das Almas, BA, Brasil. E-mail: onildo.nunes@embrapa.br

Introdução

O reino vegetal é responsável pela maior parcela da diversidade química conhecida e registrada na literatura. Medicamentos oriundos de espécies vegetais revolucionaram o tratamento de diversas patologias como as crônicodegenerativas (VIEGAS; BOLZANI; BARREIRO, 2006; NEWMAN; CRAGG, 2012; RODRIGUES, 2018).

A doença de Alzheimer (DA) é umas das principais doenças neurodegenerativa descrita na literatura, que leva a uma desordem progressiva e crônica, na qual há um comprometimento de funções corticais, incluindo memória, raciocínio, orientação, compreensão, cálculo, capacidade de aprendizagem, linguagem e julgamento, caracterizada pela destruição de neurônios colinérgicos, sendo uma das principais causas de demência no mundo (HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2011).

Atualmente os inibidores das colinesterases (I-ChE) são os principais medicamentos utilizados para o tratamento específico da doença de Alzheimer, cujo uso baseia-se no pressuposto déficit colinérgico que ocorre na doença, visando o aumento da disponibilidade sináptica de acetilcolina, através da inibição das suas principais enzimas catalíticas, a acetil e a butirilcolinesterase. Os inibidores da colinesterase têm como resultado concentrações mais elevadas de acetilcolina, conduzindo a um acréscimo da comunicação entre as células nervosas, o que por sua vez pode, temporariamente, melhorar ou estabilizar os sintomas da demência (FERNANDES, 2017).

Contudo vale ressaltar a importância de novos métodos de tratamento para essa patologia que vem crescendo demasiadamente devido ao aumento da longevidade. Com isso, os produtos naturais apresentam-se como as melhores opções para encontrar moléculas potenciais, por serem adquiridas de fontes renováveis, além de servirem como estímulos terapêuticos poderosos e, também, como modelos para a síntese de moléculas derivadas que apresentem maior afinidade por certos sítios de ação (DRASAR; KHRIPACH, 2020).

O reino vegetal contribui de forma volumosa para a síntese de moléculas com atividades farmacológicas, entretanto, mesmo as plantas sendo fontes naturais, não é sinônimo de inocuidade e devem ser realizados estudos toxicológicos para comprovar sua segurança (RAHMAN; PRATAMA, 2019).

Posto isso, testes alternativos vêm sendo estudados, como a avaliação da toxicidade do composto vegetal frente a Artemia salina. Esse teste vem ganhando espaço dentro dos ensaios toxicológicos devido a sua rapidez, fácil reprodutibilidade e grande confiabilidade dos resultados (RAHMAN; PRATAMA, 2019). O teste com o microcrustáceo A. salina é uma metodologia extensamente utilizada na linha de pesquisa de produtos naturais para avaliar o potencial tóxico de extratos e substâncias isoladas. Ela é utilizada em testes de toxicidade aguda devido sua praticidade de manuseio e cultivo, por ser um método rápido e barato, aplicável como bioindicador em uma avaliação toxicológica pré-clínica (CARVALHO et al., 2009).

Estudos trazem correlação da toxicidade frente à A. salina, com atividades antifúngica, virucida, antimicrobiana, parasiticida, antimalárica entre outras (CARBALLO et al., 2002; MACRAE; HUDSON; TOWERS, 1988; SIQUEIRA et al., 1998; SOLIS et al., 1993; ZANI et al., 1995). Além da correlação com atividades farmacológicas, essa metodologia tem sido empregada como bioindicador em ecotoxicologia avaliando contaminantes presentes em águas e efluentes, como também indicador de toxicidade pela exposição a metais tóxicos, pesticidas, herbicida e toxinas fúngicas (COSTA, 2018; LHULLIER; HORTA; FALKENBERG, 2006).

O gênero Passiflora possui potencial químico para aplicação em diversas áreas. Estudos trás abordagens numerosas de atividades farmacologias atribuídas a esse gênero como capacidade antioxidante, antibacteriana, anti-hemolítica (BANDARA; PADUMADASA; PEIRIS, 2018), potencial citotóxico (AMARAL et al., 2019), efeito hipoglicemiante e hipolipidêmica (SUDASINGHE; PEIRIS, 2018), atividade antifúngica (NUNES, 2021), além de efeitos positivos para ação depurativas, sedativas e anti-inflamatórias (LOPES; TIYO; ARANTES, 2017), atividade antiulcerogênica (NETO, 2015).

Ação diurética, analgésica, efeitos positivos na aplicação em tratamentos de toxicodependentes, de obesidade, de algumas infecções e melhora em sintomas da menopausa (PERDOMO, 2016). Na medicina popular utilizada para diferentes enfermidades associada ao sistema nervoso como ansiedade, depressão e insônia (SILVA, 2020).

Diante do exposto, o presente trabalho teve como finalidade avaliar a capacidade inibitória dos extratos brutos de Passiflora suberosa frente à enzima acetilcolinesterase, bem como seu potencial toxico frente ao microcrustáceo A. salina, contribuindo, assim, para o conhecimento científico desta espécie que tem sido pouco explorada do ponto de vista farmacológico.

Material e Métodos

Coleta

e identificação do material vegetal

A coleta das partes aéreas do acesso BGP 152 de Passiflora suberosa ocorreu na cidade de Cruz das Almas - Bahia, na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) Mandioca e Fruticultura, e a exsicata foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da UFRB (campus Cruz das Almas) identificada como HURB 18340. Posteriormente, o material vegetal foi encaminhado para o Laboratório de Extração de Produtos Naturais (LAEX) no Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana. A autorização de acesso ao patrimônio genético vegetal foi obtida junto ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (A4B0455).

Preparo dos extratos

O material coletado foi submetido à secagem em estufa a 45±3°C, por 5 dias, até o peso constante. Após a secagem, esse material foi moído em liquidificador industrial e, em seguida, submetido a extração por maceração em metanol, com troca do solvente extrator a cada 5 dias por 5 vezes consecutivas. Os filtrados obtidos foram concentrados em evaporador rotativo sob pressão reduzida, com banho em temperatura de 50±3°C.

Após obtenção do extrato metanólico seco, uma alíquota foi retirada para a realização das análises subsequentes, sendo que a massa restante submetida à partição líquido-líquido, utilizando solventes de diferentes polaridades (hexano, clorofórmio e acetato de etila) para obtenção dos respectivos extratos.

Avaliação da atividade inibitória da Acetilcolinesterase

O teste foi realizado pelo método de ELLMAN et al. (1961) com adaptações (RHEE et al., 2001). Utilizando uma microplaca placa de 96 poços, foram adicionados 140 µL de tampão fosfato (pH 7) somado com albumina (0,1%) em todos os poços, seguidamente acrescentando 20 µL da enzima acetilcolinesterase (AChE) tipo VI-S obtida de Electroparaus electricous (Sigma-Aldrich®) diluída (0,15 U/mL) e 20 µL dos extratos teste, na concentração de 1000 µg/mL dissolvidas em etanol, incubado por 10 minutos a temperatura de 37 ± 1 C°. Após esse período, adicionou-se 10 µL do reagente de Ellman (DTNB) (10 mM) e, por fim, 10 µL do reagente iodeto de acetiltiocolina (14 mM). A leitura das absorbâncias foi realizada em leitor de microplacas Multiskan™ GO 3.2 a 405 nm nos tempos de 0 e após 30 minutos de reação. O padrão comercial utilizado como controle positivo a Eserina (fisiostigmina) 500 µM, como controle negativo ou branco utilizado foi o etanol 10%.

A porcentagem de inibição foi calculada, conforme a Equação: %IAChE = (������ − ������) / ������ �� 100. Em que, %IAChE é a porcentagem de inibição da AChE, ΔAb é a diferença de absorbância do branco no tempo de 10 minutos e no tempo inicial, enquanto ΔAi é a diferença de absorbância do inibidor (padrão ou amostra) no tempo de 10 minutos e no tempo inicial.

Teste de letalidade frente à Artemia salina

O teste foi fundamentado no método elaborado por MEYER et al. (1982) e adaptado por SERRANO, ORTEGA e VILLAR (1996). No experimento foram utilizados ovos do microcrustáceo Artemia salina, onde esses foram incubados

em aquário com água do mar artificial, dissolvendo 19g de sal marinho em 5L de água mineral. O aquário foi dividido em duas partes, com divisória de isopor, que possuía pequenos orifícios para permitir a passagem dos nauplii de A. salina entre os diferentes lados. A menor parte do aquário foi revestida com papel alumínio para impedir a entrada de luz, enquanto a maior parte foi iluminada com o auxílio de uma lâmpada incandescente de 60W, para que os nauplii recém eclodidos migrassem para a luz e pudessem ser recolhidos com maior facilidade.

A oxigenação do aquário foi realizada com bomba de ar apropriada. Os ovos de A. salina foram adicionados à parte escura do aquário para eclosão e, após 24h, dez nauplii recém-eclodidos foram coletados com auxílio da pipeta Pasteur e adicionados a tubos de ensaios contendo os extratos bruto, hexânico, clorofórmico e acetato de etila, nas concentrações de 1000, 500 e 100 µg/mL, com volume de 5mL, por 24 horas e, após esse intervalo, foram contados os nauplii sobreviventes. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Para confiabilidade do teste, houve a realização concomitante de um teste em branco, utilizando apenas água. A porcentagem da letalidade frente à Artemia salina (%LAS) das amostras foram determinados pela fórmula %LAS = (n° de mortos no teste – n° de mortos no branco / n° de sobreviventes no branco) x 100. Sendo considerado ativo o extrato que apresentar a Concentração Letal Média (CL50) menor que 1000µg de extrato.

Análise estatística

As análises passaram por tratamento estatístico descritivo, sendo as metodologias realizadas em triplicata. Os resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Para os testes foi utilizada a regressão linear, sendo considerados valores de R2≥0,99. As análises estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância (ANOVA), utilizando o teste de Tukey e o teste de Scott-Knott para a comparação das médias obtidas, através do programa SISVAR® versão 5.7. Valores de p<0,05 foram considerados como indicativos de significância.

Resultados e Discussão

Os testes de avaliação da atividade inibitória da enzima Acetilcolinesterase foram realizados com os extratos Bruto (EB), hexânico (EH), clorofórmico (EC) e de acetato de etila (EA) das partes aéreas de P. suberosa (tabela 1).

Tabela 1. Atividade inibitória da Acetilcolinesterase dos extratos de Passiflora suberosa

EXTRATOS (10mg/mL)

ESERINA

Média das absorbâncias em 30 minutos % Inibição

0,27±0,16 a 100,00 a EB 2,43±0,25 b 0,01 b EH 2,59±0,32 b 0,01 b EC 2,15±0,18 c 27,16 c EA 27±0,06 d 33,56 d

Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5%. Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autora (2022).

VINHUTA (2007) classifica atividade do teste de inibição da Acetilcolinesterase potente quando a inibição da enzima é maior que 50%, inibição moderada de 50% a 30% e baixa atividade quando a inibição é inferior a 30%.

Assim, avaliando os resultados observados para os extratos de P. suberosa BGP 152, é possível verificar que o extrato clorofórmico apresentou baixa atividade, com porcentagem de inibição da enzima inferior a 30%, e o extrato em acetato de etila apresentou atividade classificada como moderada, com inibição de 33,56%. Os extratos, bruto e hexânico, não apresentaram atividade inibitória frente à enzima. Entretanto, os valores de inibição dos extratos foram insatisfatórios para o cálculo do CE50, não alcançando valores estatísticos para a realização desse cálculo.

LIMA et al. (2018) realizaram ensaios de atividade anticolinesterásica com resíduos de maracujá (P. edulis), e observaram baixo poder de inibição (10%). MELO FILHO et al. (2018), em testes realizados com o extrato de P. foetida, obtiveram 96,46% de inibição da enzima AChE para esta espécie na concentração máxima de 10 mg/mL, utilizando como padrão eserina e galantamina, com 91,93% e 94,36%, respectivamente.

Os resultados do teste de letalidade sugerem que todos os extratos de P. suberosa apresentaram toxicidade frente ao microcrustáceo A. salina (Tabela 2).

Tabela 2. Potencial da letalidade frente à A. salina dos extratos de P. suberosa Concentração EB EH EC EA

1000 µg/mL 100±0,02b 100±2,54b 100±1,21b 100±1,21b

500 µg/mL 100±0,32b 94,44±2,20b 100±0,05b 100±2,20b 100 µg/mL 89,16±1,80b 63,33±4,41a 100±0,81b 97,50±2,88b Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5%. Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autora (2022).

Não foi possível determinar os valores de CL50 através da equação por regressão linear, devido a quantidade insuficiente de massa da amostra, porém pelos resultados da % LAS encontrados na tabela 2, sugere que todos os extratos de P. suberosa apresentaram toxicidade frente A. salina. Pois, segundo a classificação de MEYER et al. (1982 apud RIBEIRO et al., 2014) que estabeleceram uma relação entre o grau de toxicidade e a dose letal média (CL50) apresentada por extratos de plantas sobre A. salina, onde %LAS acima 1.000µg/mL, estes, são considerados atóxicos.

NGUTA et al. (2011), classificam amostras com valores de CL50 inferiores à 100µg/mL como altamente tóxicos para o microcrustáceo, valores entre 100 e 500µg/mL são moderadamente tóxicos, entre 500 e 1000µg/mL são suavemente tóxicos e acima de 1000µg/mL atóxicos. Então, de acordo com essa segunda classificação, todos os extratos podem ser considerados altamente tóxicos, pois estatisticamente mostraram letalidade superior à 50% na menor concentração testada, indicando que o CL50, desses extratos são inferiores a 100 µg/mL.

BANDARA, PADUMADASA e PEIRIS (2018) avaliaram a capacidade toxicológica do extrato metanólico e aquoso frente ao microcrustáceo A. salina da espécie Passiflora suberosa, o teste revelou que tanto o extrato metanólico quanto o extrato aquoso foram capazes de exibir efeitos tóxicos com valores de CL50 em 60,3 e 309 µg/mL, respectivamente, utilizando como controle positivo dicromato de potássio e água do mar com DMSO como controle negativo. A atividade tóxica exibida pelo extrato aquoso foi cerca de cinco vezes e meia mais potente do que o extrato de metanólico.

RAHMAN et al. (2011), realizaram o bioensaio com a espécie P. foetida, apresentando CL50 40µg/mL para o extrato etanólico. Já ASADUJJAMAN et al. (2014), realizaram o teste com o extrato etanólico de P. foetida e obteve o valor de CL50 80μg/mL.

Estudos realizados por RIPA et al. (2009) com a espécie P. edulis apresentaram CL50 de 11,17µg/mL para o extrato em éter de petróleo das folhas e 6,89µg/mL para o extrato do caule, 7,91µg/mL para o extrato clorofórmio de folha e 6,63µg/ mL para o extrato de clorofórmio do caule.

Nesse teste o valor do CL50 dos extratos teve como padrão positivo Sulfato de vincristina que apresentou CL50 5,68µg/mL. Na literatura é descrito que substâncias de extratos de plantas com CL50<100µg/mL são consideradas muito ativo comparando a substâncias camptotecina e sulfato de vincristina, substâncias essas utilizadas para o tratamento de algumas neoplasias (SCHRIPSEMA; DAGNINO; GOSMANN, 2007; HARADA, 2009).

Assim, o teste de letalidade frente à Artemia salina é um ensaio abrangente, sendo empregado como bioindicador avaliando diversos tipos de contaminantes presentes em águas, utilizado em avaliação de toxicidade aguda relacionados

a extratos de plantas e indicativo preliminar para avaliação de diversas atividades biológicas (LIMA, 2011; ANDRADE, 2017).

Conclusão

A espécie P. suberosa é pouco explorada em comparação com outras espécies do gênero. Sendo assim impulsionou o estudo do espécimen P. suberosa BGP 152. Os testes de atividades biológicas realizados com seus extratos mostraram baixa atividade inibitória da enzima Acetilcolinesterase pelo método escolhido.

O teste de toxicidade evidenciou que todos os extratos são tóxicos ao microcrustáceo Artemia salina, apontando uma melhor atividade para o extrato clorofórmico.

Esses resultados podem justificar outros estudos de atividades biológicas envolvendo essa espécie, a continuidade do fracionamento até possivelmente o isolamento e identificação dos componentes químicos presentes nos extratos e, além disso, ampliar o conhecimento científico dessa espécie já conhecida, porém pouco explorada no meio científico.

Agradecimentos

Às agências CNPq, FAPESB e CAPES pelo apoio financeiro.

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Avaliação in vitro do potencial biológico da espécie Passiflora suberosa L.

Glaucia L. P. L. Neco1, Anne R. de Santana2, Danielle F. da Silva3, Diego M. da Costa4, Clayton Q. Alves5 e Hugo N. Brandão6

Resumo

O emprego de espécies vegetais para tratamento de patologias perpassa toda evolução humana. Como exemplo, pode-se citar o gênero Passiflora, comumente utilizado na medicina popular. Desse modo, a espécie Passiflora suberosa foi escolhida como alvo desse estudo. Avaliado o teor de fenólicos totais foi realizado através do método de Folin Ciocalteau, indicando a maior concentração para o extrato acetato de etila (15,58±0,029mg EAG/100g de extrato) e o teor de flavonoides totais foi realizado através do método de complexação com cloreto de alumínio (AlCl3) em que, a maior concentração foi encontrado no extrato clorofórmico, seguido do extrato hexânico e acetato de etila que não diferiram estatisticamente (8,93±0,025; 7,95±0,081; 8,046±0,017mg de EQ/100g de extrato). Os valores obtidos para o sequestro do radical livre DPPH• (2,47±0,02mg/mL), e o teste de inibição da auto-oxidação do β-caroteno (77,78±2,94%), mostraram melhor potencial antioxidante para o extrato acetato de etila, em ambos os métodos. Em suma, esse estudo demonstra o potencial biológico dessa espécie ainda pouco explorada pela comunidade científica.

Palavras-Chave: Passifloraceae; fitoquímica; metabólitos secundários; fenólicos; atividade antioxidante.

Abstract

(In vitro evaluation of the biological potential of the species Passiflora suberosa L.) The use of plant species for the treatment of pathologies permeates all human evolution. As an example we have the genus Passiflora, commonly used in folk medicine. Thus, the species Passiflora suberosa was chosen as the target of this study. The total phenolic content was performed using the Folin Ciocalteau method, indicating the highest concentration for the ethyl acetate extract (15.58±0.029mg EAG/100g of extract) and the total flavonoid content was performed using the complexation with aluminum chloride (AlCl3) in which the highest concentration was found in the chloroform extract, followed by the hexane extract and ethyl acetate that did not differ statistically (8.93±0.025; 7.95±0.081; 8.046± 0.017mg of EQ/100g of extract). The values obtained for DPPH• free radical scavenging (2.47±0.02mg/mL), and the β-carotene auto-oxidation inhibition test (77.78±2.94%), showed better antioxidant potential for the ethyl acetate extract in both methods. In short, this study demonstrates the biological potential of this species still little explored by the scientific community.

Keywords: Passifloraceae; photochemistry; secondary metabolites; phenolics; antioxidant activity.

Introdução

A família Passifloraceae dispõe de cerca de 16 gêneros e 650 espécies, sendo o gênero Passiflora considerado o mais representativo, com cerca de 400 espécies (RAMOS et al., 2007). A abundância genética, associada à sua ampla distribuição geográfica faz com que as espécies desta família sejam consideradas de extrema importância biológica (RICHARDO, 2018).

O gênero Passiflora apresenta sua distribuição geográfica em áreas tropicais, subtropicais e temperadas do mundo (DEGINANI, 2001; IRVINE, 2010; PORTER-UTLEY, 2014; RAMOS, 2007) e, dentre as plantas com finalidade terapêutica de destaque no Brasil, as espécies deste gênero são frequentemente reportadas por apresentarem atividades farmacológicas ampla, indo desde ação sobre o sistema nervoso central com atividade sedativa, calmante, até ativida

1 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: glaucialaisneco@hotmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: anneramosdesantana@gmail.com

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail:dfsilva@uefs.br

4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: diegocost@live.com

5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cqalves@uefs.com

6 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.com

frente a patógenos como vírus e bactérias (QURESHI et al., 1997; LOPES, 2017; ESPINHEIRA; SILVA; SOUZA, 2019). Outras ações terapêuticas como: ansiolítica, anti-inflamatória, antioxidante, hepatoprotetora, anti-hiperglicêmica, antiespasmódica, anti-hipertensiva, hipolipidemiante e cicatrizante são também atribuídas às espécies deste gênero (GOSMANN et al., 2011; COSTA, 2013; BRASIL, 2014; PALMA, 2017).

O Brasil é um dos países com maior diversidade de espécies de Passiflora com ocorrência de aproximadamente 142 espécies, onde 83 dessas são endêmicas, tornando o país um dos principais centros de diversidade genética (BERNACCI et al., 2015).

Assim, tendo em vista que muitas espécies do gênero Passiflora são pouco exploradas do ponto de vista fitoquímico e farmacológico, bem como à riqueza de metabólitos bioativos produzidos por estas espécies, este trabalho teve por objetivo avaliar o teor de fenólicos e flavonoides totais, bem como a atividade antioxidante dos extratos de Passiflora suberosa L.

Material e Métodos

Coleta do material vegetal

A coleta das partes aéreas do acesso de P. suberosa ocorreu em julho de 2018, na EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, localizada na cidade de Cruz das Almas - Bahia, situado nas coordenadas geográficas: 12º40'39'' latitude sul e 39º06'23'' longitude oeste de Greenwich e altitude de 226 metros. A exsicata foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB) - (campus Cruz das Almas) identificada como HURB 18340. A autorização de acesso ao patrimônio genético vegetal foi obtida junto ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (A4B0455).

Obtenção dos extratos e frações

O material coletado foi submetido à secagem em estufa a 45±3°C, por 5 dias, até peso constante e, após a secagem, foi moído em liquidificador industrial. A extração ocorreu através do método de maceração, utilizando metanol como solvente extrator, sendo o solvente renovado a cada 5 dias, repetindo essa operação por 5 vezes. Os filtrados obtidos em cada etapa foram reunidos e concentrados em evaporador rotativo sob pressão reduzida, com banho em temperatura de 50±3°C. Depois da obtenção do extrato metanólico seco, uma alíquota foi retirada para a realização das análises subsequentes e a massa restante foi submetida à partição líquido-líquido, utilizando solventes de diferentes polaridades (hexano, clorofórmio e acetato de etila) para obtenção dos respectivos extratos.

Determinação de fenólicos e flavonoides totais

A análise do teor de fenólicos foi realizada com base no método colorimétrico de Folin Ciocalteau (FC) com modificações (GEORGÉ et al., 2005). Resumidamente, foram preparadas soluções aquosas do reagente de FC (1:10) e de carbonato de sódio (7,5%) em água destilada. O padrão foi preparado pesando-se 30 mg do ácido gálico e dissolvendo em 300 mL de água destilada. Em seguida, a solução de ácido gálico foi diluída em concentrações menores, variando de 10200 µg/mL.

As amostras testadas foram obtidas dissolvendo-se 10 mg do extrato em 10 mL de metanol (MeOH). Posteriormente, foram adicionados 0,5 mL da amostra e das diferentes concentrações de ácido gálico em tubos de ensaios. O branco foi preparado somente com água destilada.

Em cada tubo, incluindo o branco, foram adicionados 2,5 mL do reagente FC, agitando-os em seguida para proporcionar mistura do reagente com a amostra. Após 3 minutos, foram adicionados 2 mL da solução de carbonato de sódio 7,5% em cada tubo, seguido de agitação. Os tubos foram submetidos ao aquecimento em banho-maria a 50oC por 5 minutos e, após serem retirados, aguardaram por 15 minutos para que a reação fosse processada. Os tubos foram colocados em banho de gelo e após 3 minutos, foram transferidos 300 μL de cada um dos tubos para a microplaca do

espectrofotômetro da Thermo Scientific, modelo Modelo Multi-Scan GO e a leitura foi realizada e a λ=760 nm. A análise foi realizada em triplicata.

O teor de fenólicos totais foram determinados por interpolação da absorbância da amostra contra a curva padrão de ácido gálico (10 a 200 µg/mL), a partir da equação da curva padrão do ácido gálico Y = aX + b, onde Y é a absorbância da amostra e X a concentração.

Os resultados foram expressos em g de ácido gálico em 100g de extrato, utilizando a fórmula (g/100 g) = (C x D) / (10.000 x (M/V)), em que C = concentração obtida através da curva padrão; D = diluição da amostra; M =massa necessária para fazer o extrato; V = volume de solução extratora.

Para determinação do conteúdo de flavonoides totais foi utilizada a metodologia descrita por Pothitirat e colaboradores (2009), em que as amostras foram colocadas em contato com solução metanólica de cloreto de alumínio (AlCl3) e, após incubação, avaliadas por espectrofotometria.

Inicialmente foram preparadas soluções do padrão quercetina com concentrações que variaram de 2 a 50 µg/mL, para realização da curva de calibração. A aquisição da absorbância realizada a λ=415 nm e a partir dos resultados obtidos foi construída a curva de calibração com o padrão quercetina, cuja equação foi utilizada para o cálculo dos teores de flavonoides totais.

Para o preparo das amostras, pesou-se aproximadamente 10 mg dos extratos (bruto, hexânico, clorofórmico e acetato de etila) de P. suberosa, dissolvidos em 20 mL de metanol. Foi preparada também uma solução metanólica de cloreto de alumínio a 2%.

Para o teste, foi adicionado 1,5 mL da amostra ou padrão de quercetina a 1,5 mL da solução metanólica de cloreto de alumínio em tubos de ensaio. Após 10 minutos de reação foram transferidos 300 μL de cada um dos tubos para a microplaca do espectrofotômetro da Thermo Scientific, modelo Modelo Multi-Scan GO e as amostras foram submetidas à leitura em espectrofotômetro a λ=415 nm.

Para o branco, procedeu-se da mesma forma que as demais amostras, no entanto foi adicionado no lugar da amostra o metanol. A quantificação de flavonoides foi expressa em gramas de quercetina equivalentes EQ/ 100 g do extrato.

Teste do Sequestro do Radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH•)

A atividade antioxidante foi avaliada por meio do teste do sequestro do radical livre DPPH•, conforme a metodologia descrita por MALTERUD et al. (1993), com adaptações. Assim, foram preparadas soluções metanólicas dos extratos bruto, hexânico, clorofórmico e de acetato de etila da espécie de P. suberosa em que diferentes concentrações, objetivando estabelecer uma curva linear correlacionando % de sequestro versus concentração da amostra e a concentração efetiva para 50% de atividade (CE50) de cada extrato.

Para realização do teste, tomou-se uma alíquota de 250µL da solução de DPPH• (45μg/mL) e 4,2µL das amostras. Para o controle positivo da reação foi utilizado propilgalato na concentração de 5mg/mL, já o controle negativo foi preparado substituindo a amostra pelo mesmo volume de metanol.

A reação foi monitorada em espectrofotômetro de microplaca da Thermo Scientific, Modelo Multi-Scan GO, a λ=517nm, sendo avaliadas as absorbâncias nos tempos 0 e 15 minutos. A atividade antioxidante foi calculada pela fórmula: %������������������ = 100(��0����) (��0�� − ����) em que A0=absorbância inicial da solução de DPPH• com a amostra; Af=absorbância final da amostra após reação de 15 minutos com DPPH•; A0p=absorbância inicial do padrão e Ap=absorbância final do padrão após reação de 15 minutos com DPPH•. Após esse cálculo, foi traçado um gráfico que correlaciona porcentagem (%) de sequestro versus concentração da amostra para determinação da CE50. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

Teste de Inibição da Auto-Oxidação do β-Caroteno

Conforme metodologia descrita por HIDALGO (1994) com adaptações, foi realizado o teste que avalia a inibição da auto-oxidação do β-caroteno. A reação foi gerada pela adição do agente oxidante radicalar e o ácido linoleico, realizada em microplaca, sendo a leitura em espectrofotometria no comprimento de onda a 470nm.

Foram feitas soluções etanólicas dos extratos bruto, hexânico, clorofórmico e de acetato de etila na concentração de 10mg/mL, utilizando o propilgalato em soluções etanólicas na concentração de 1mg/mL como padrão. O meio oxidante foi composto por 10mg de β-caroteno dissolvido em 1mL de clorofórmio, posteriormente adicionado uma gota de ácido linoléico e 0,4mL do emulsificador Tween 40.

Seguidamente, para a retirada do clorofórmio foi utilizado o rotaevaporador e então adicionado 100mL de água destilada com agitação, a fim de promover a aeração. Após essa etapa foram adicionados à microplaca 10µL das amostras na concentração de 10mg/mL, dos extratos bruto, hexânico, clorofórmico e de acetato de etila e o mesmo volume do padrão e 250µL do meio oxidante.

Sucessivas leituras foram realizadas até o tempo máximo estabelecido de 60 minutos, sendo a primeira consideranda o tempo zero e as intermediárias a cada 15 minutos. O branco da reação foi preparado com 250µL do meio oxidante e 10µL de etanol. A atividade antioxidante (AA) foi expressa em porcentagem, e calculada de acordo com a fórmula: AA = 100[1 − (���� ����) (������ ������)], sendo que: A0 = Absorbância inicial da amostra, At = Absorbância final da amostra, A0B = Absorbância inicial do branco e AtB = Absorbância final do branco.

Análise estatística

As análises passaram por tratamento estatístico descritivo, sendo as metodologias realizadas em triplicata. Os resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Para os testes foi utilizada a regressão linear, sendo considerados valores de R2≥0,99. As análises estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância (ANOVA), utilizando o teste de Tukey e o teste de Scott-Knott para a comparação das médias obtidas, através do programa SISVAR® versão 5.7. Valores de p<0,05 foram considerados como indicativos de significância.

Resultados e Discussão

As partes aéreas da espécie de P. suberosa foram submetidas à secagem em estufa até atingir peso constante que, após pulverizadas, resultaram em 1.435,28g do material vegetal. O material pulverizado foi submetido ao método de maceração, e o extrato final obtido teve seu peso calculado em 143,01g, correspondendo a um rendimento de 9,97%, em relação à massa do material pulverizado. A tabela 1 indica a codificação, peso seco e rendimento dos extratos após o processo de partição.

Tabela 1. Codificação, peso seco e rendimento dos extratos de P. suberosa BGP 152

Passiflora suberosa EB EH EC EA

Peso seco (g) Rendimento (%) 143,01 Corresponde a 100%

23,84 16,67 3,20 2,24 1,66 1,16

Fonte: Autores (2022)

Em consideração a abundância de compostos presentes no extrato bruto, a finalidade do método de partição líquidolíquido envolveu a distribuição dos compostos entre as duas fases líquidas imiscíveis, para que se consiga extrair substâncias com polaridades semelhantes, concentrado em um extrato.

A partição de extrato metanólico bruto com hexano favorece a extração de esteróides, flavonoides metoxilados, terpenos e acetofenonas; com clorofórmio, a de lignanas, flavonoides, sesquiterpenos, lactonas, triterpenos e cumarinas; enquanto o acetato de etila possibilita a extração de flavonoides, taninos, xantonas, ácidos triterpênicos, saponinas e

compostos fenólicos em geral (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998). Os resultados na tabela 1 atestam que as substâncias presentes no extrato bruto de P. suberosa possuem compostos de maior afinidade pelo solvente orgânico hexânico e em contrapartida compostos de menor afinidade pelo solvente acetato de etila, apresentando um baixo rendimento. Os extratos de P. suberosa foram submetidos ao teste de identificação e quantificação de fenólicos e flavonoides totais. O teste de fenólicos permite identificar a presença dessas substâncias e quantificar as mesmas através da equação da reta obtida pela curva de regressão linear. o valor do coeficiente de correlação (R2) de 0,9981.

Através da equação da reta y = 0,0066x + 0,0966, foram calculados o teor de substâncias fenólicas presentes nos extratos, expressos os resultados correlacionando com a equivalência de ácido gálico (mg EAG/100g de extrato), os quais estão apresentados na tabela 2.

Tabela 2. Teor de fenólicos totais obtidos nas amostras Extratos de P. suberosa EB EH EC EA

Fenólicos totais (mg EAG/g de extrato) 3,94±0,013c 3,14±0,001b 2,52±0,005a 15,58±0,029d

Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5% Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autores (2022).

Majoritariamente, a concentração de compostos fenólicos estão presentes no extrato acetato, mediante a quantificação de fenólicos totais pelo método de Folin Ciocalteau. Compostos fenólicos apresentam maior afinidade por solventes de maior polaridade, portanto, justifica-se o fato de o EA ter a maior presença desses compostos.

Para o teste de flavonoides totais, a presença dessas substâncias foi quantificada em relação ao padrão quercetina através da equação da reta y = 0,03x + 0,2155, obtida pela curva de regressão linear e coeficiente de correlação R2 de 0,9998. O conteúdo de flavonoides totais obtidos pelo método de complexação com cloreto de alumínio (AlCl3), foi expresso em mg de EQ/100g de extrato.

Tabela 3. Teor de flavonoides totais obtidos nas amostras Extratos de P. suberosa EB EH EC EA

Flavonoides totais (mg QE/g de extrato) 4,49±0,009a 7,95±0,081b 8,93±0,025c 8,046±0,017b

Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5% Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autores (2022).

Segundo demonstrado na tabela 3, a maior concentração de flavonoides foi encontrada no extrato clorofórmico, seguido do extrato acetato de etila e do extrato hexânico, que não se diferenciam estatisticamente.

Os flavonoides são comumente compostos polares, tais como os flavonoides glicosilados, o que justifica a sua presença no extrato acetato de etila. Porém, a polaridade dos flavonoides pode variar, até substâncias apolares, como os flavonoides esterificados, metilados ou não substituídos, o que evidencia a presença desses compostos no extrato clorofórmico e hexânico, devido à natureza do extrato (GOMES, 2013).

Esses mesmos extratos foram submetidos a avaliação da sua capacidade antioxidante, sendo realizado pelo método do sequestro do radical livre DPPH• e pela avaliação da capacidade de proteção do β-Caroteno da auto-oxidação.

Os extratos de P. suberosa foram submetidos ao teste do sequestro do radical livre DPPH•, e tiveram a atividade da capacidade sequestrante calculada a partir dos valores das absorbâncias para cada extrato (tabela 4), sendo possível correlacionar as concentrações das amostras versus os valores da % de DPPH• sequestrado.

Tabela 4. Valores do CE50 do Sequestro do Radical DPPH• dos extratos de P. suberosa EXTRATO EB (%) EH (%) EC (%) EA (%) Propilgalato*

CE50 (Em mg/L) 8,33±0,21c 11,74± 0,21d 8,40±0,30c 2,47±0,02b 0,21±0,01a Propilgalato* controle positivo

Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autores (2022).

O EA foi o mais ativo entre os demais extratos com CE50 2,47mg/mL, e de acordo com o teste de Scott-Knott o EB e o EC, não apresentaram diferença estatística nos valores de CE50, seguido do EH que apresentou o maior valor de CE50.

Foi concomitantemente determinado a CE50 do propilgalato, utilizado como controle positivo do ensaio, sendo esse um composto antioxidante de estrutura química conhecida. O EB se apresenta como uma mistura complexa de compostos químicos, e essas substâncias podem agir de forma sinérgica ou antagônica frente a uma determinada atividade biológica. O EA se mostrou mais ativo, evidenciando que o processo de partição líquido-líquido possibilitou a obtenção de extratos semipurificados, justificando o aumento da atividade biológica com a concentração dos compostos responsáveis pela atividade no EA.

Foi ainda avaliada a capacidade dos extratos de P. suberosa de proteger o β-Caroteno, substrato lipídico, da autooxidação. Os resultados encontram-se na tabela 5.

Analisando os resultados obtidos é possível observar que, na concentração de 10mg/mL, os extratos EB e EH tiveram a capacidade de proteger o β-Caroteno da auto-oxidação inferior a 50%, já EA e o EC, não se diferiram estatisticamente, exibindo capacidade superior a 70%.

Uma vez que os antioxidantes naturais provenientes de plantas podem atuar através de vários mecanismos, tornase necessário avaliar esse potencial por mais de uma metodologia, levando em consideração a variabilidade estrutural dos compostos naturais e a capacidade deste em expressar a atividade biológica por vários mecanismos.

Tabela 5. Atividade de Inibição da Auto-Oxidação do β-Caroteno dos extratos de P. suberosa. EXTRATOS (10mg/mL) % de inibição

PROPILGALATO* 88,74±1,67c EB 45,72±9,81b EH 19,08±0,17a EC 71,85±2,84c EA 77,78±2,94c * PROPILGALATO (controle positivo) na concentração de 1mg/mL. Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5%. Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autores (2022).

A relação entre concentração de compostos fenólicos e a capacidade antioxidante de extratos é expressiva, visto que extratos com maior conteúdo de fenóis são justamente os extratos com maior atividade antioxidante. Compostos dessa classe têm recebido atenção por serem os principais responsáveis pela atividade antioxidante presentes em vegetais (LIMA et al., 2006; VIEIRA et al., 2015).

Nas plantas, os compostos fenólicos as protegem contra danos teciduais, contra a ação de subprodutos provenientes da fotossíntese e contra animais herbívoros (OLIVEIRA, 2014). Como agentes antioxidantes, os compostos dessa classe são considerados multifuncionais, agindo combatendo os radicais livres através da doação de um átomo de hidrogênio de um grupo hidroxila (OH); apresentando capacidade de suportar um elétron desemparelhado; quelando metais de transição;

interrompendo a reação de propagação dos radicais livres na oxidação lipídica; modificando o potencial redox do meio e reparando lesões decorrente de ataque dos radicais livres em moléculas (PAZINATO, 2017).

Os flavonoides representam um dos grupos dos compostos fenólicos, sendo responsável também por inúmeras funções nas plantas. Dentre elas, pode-se mencionar a proteção contra raios ultravioleta, contra insetos, fungos, vírus e bactérias, e a capacidade de proporcionar a atração de animais polinizadores. Do ponto de vista farmacológico estudos demonstraram propriedades antiviral, atividade antitumoral, anti-inflamatória, antioxidante, atividade hormonal entre outras para esses compostos (DOS SANTOS; RODRIGUES, 2017).

Conclusão

Os compostos fenólicos, em especial os flavonoides compõem a principal categoria presente nas espécies de Passiflora, sendo considerado com marcadores quimiotaxonômicos da espécie, além de apresentarem comprovadas atividade farmacológicas. O presente trabalho permitiu apontar o potencial biológico da espécie Passiflora suberosa, sendo essa uma espécie ainda pouco explorada do ponto de vista farmacológico e químico.

Agradecimentos

Às agências CNPq, FAPESB e CAPES pelo apoio financeiro.

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Caracterização química e estudo biomonitorado de extratos de Polygala boliviensis A.W. Benn (Polygalaceae)

Resumo

Polygala spp. são utilizadas popularmente por apresentarem diferentes atividades biológicas, como ação na inflamação, problemas cardiovasculares e desordens do sistema nervoso, porém a Polygala boliviensis é pouco estudada química e biologicamente. O objetivo do trabalho foi realizar a caracterização química e o estudo biomonitorado dessa espécie. Partes aéreas e raízes foram secas e trituradas e submetidas à maceração com metanol, seguida de partição, que resultou nos extratos hexânico (EHPB), clorofórmico (ECPB) e acetato de etila (EAPB). Na análise por CLAE-DAD foi determinado o fingerprint dos extratos, observando a presença de ácidos fenólicos, flavonoides e cumarinas. O teor de flavonoides totais e a atividade antioxidante foi maior para o EAPB. Após o fracionamento, por cromatografia em coluna (CC), a FAPB13 foi a mais ativa, sendo comparável ao extrato de Ginkgo biloba. A letalidade frente à Artemia salina e atividade anticolinesterásica mostrou que o ECPB teve maior atividade. Ao ser fracionado por CC, a FCPB04 apresentou menor CL50, e a FCPB08 maior atividade anticolinesterásica. O presente estudo fornece resultados inéditos acerca da P. boliviensis, tanto do ponto de vista químico, como biológico. Assim, acredita-se que a P. boliviensis apresenta perspectivas promissoras de estudo, com potencial de descoberta de substâncias bioativas.

Palavras-Chave: Artemia salina; atividade anticolinesterásica; CLAE-DAD; DPPH; flavonoides.

Abstract

(Chemical characterization and biomonitored study of extracts of Polygala boliviensis A.W. Benn (Polygalaceae)). Polygala spp. are popularly used due to their different biological activities, such as action on inflammation, cardiovascular problems and nervous system disorders, but Polygala boliviensis is poorly studied chemically and biologically. The objective of the work was to carry out the chemical characterization and the biomonitored study of this species. Aerial parts and roots, dried and ground, were subjected to maceration with methanol, followed by partitioning, which resulted in hexane, chloroform (ECPB) and ethyl acetate (EAPB) extracts. In the HPLC-DAD analysis, the fingerprint of the extracts was determined and the presence of phenolic acids, flavonoids and coumarins were observed. The total flavonoid content and antioxidant activity were higher for EAPB. After fractionation by column chromatography (CC), FAPB13 was the most active when comparable to Ginkgo biloba extract. The lethality against Artemia salina and anticholinesterase activity showed that ECPB had greater activity. When fractionated by CC, FCPB04 had the lowest LC50, and FCPB08 had the highest anticholinesterase activity. The present study provides unprecedented results about P. boliviensis, both from a chemical and biological point of view. Thus, it is believed that P. boliviensis presents good study prospects, with interesting potential to be discovered.

Keywords: Artemia salina; anticholinesterase activity;HPLC-DA; DPPH; flavonoids.

Introdução

Estudos apontam o uso tradicional de espécies de Polygala, para inflamação, problemas cardiovasculares e desordens do sistema nervoso. Por isso, muitos estudos químicos e biológicos foram realizados com algumas espécies, sendo as mais estudadas P. altomontana, P. caudata, P. flavescens, P. glomerata, P. japonica, P. molluginifolia, P.

1 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: dfsilva@uefs.br

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: jessica_uefs2011@hotmail.com

3 Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana, Avenida Luiz Eduardo Magalhães, S/N, CEP 44079-002, Feira de Santana, BA, Brasil, Email: luizcarneiro86@gmail.com

4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cleiroz@gmail.com

5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.br

sibirica e P. tenuifolia (LACAILLE-DUBOIS; DELAUDE; MITAINE-OFFER, 2020). No entanto, a espécie Polygala boliviensis, nativa do Brasil, apresenta poucos estudos químicos e biológicos.

A caracterização química de espécies vegetais comumente é realizada através da fitoquímica clássica, a qual permite o isolamento e identificação de substâncias. No entanto, as substâncias identificadas podem ou não ter atividade biológica. Nesse sentido, o estudo biomonitorado visa o isolamento e identificação de substâncias com atividade biológica ou farmacológica, e não somente com foco ao isolamento e determinação estrutural (MORAIS et al., 2020).

Além disso, devido à complexidade de avaliar cada composto de um extrato vegetal de forma individual, a utilização do fingerprint vem sendo utilizada a fim de caracterizar esses extratos. Dentre as técnicas para esse fim, a cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos e/ou espectrometria de massas ganharam destaque e tem sido amplamente utilizada para esse fim (FANTOUKH et al., 2022).

Nesse sentido, o trabalho teve como objetivo realizar a caracterização química, por meio do fingerprint por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD), bem como investigar a quantificação de flavonoides totais e o estudo biomonitorado, através das atividades antioxidante, anticolinesterásica e letalidade frente à Artemia salina, da espécie P. boliviensis

Material e Métodos

Material vegetal e obtenção do extrato

A coleta, identificação do material vegetal, obtenção do extrato, partição e coluna cromatográfica da fração clorofórmica foram descritos anteriormente por SILVA (2016).

A espécie P. boliviensis foi coletada em julho de 2013 no campus da Universidade Estadual de Feira de Santana, na cidade de Feira de Santana, BA. A identificação da espécie foi realizada por um botânico especialista na família o Dr. Floriano Bârea Pastore, a partir da comparação com voucher depositado no herbário da instituição (HUEFS 168956). A autorização de acesso ao patrimônio genético vegetal foi obtida junto ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (AAE56F0).

A planta coletada foi seca em estufa e, posteriormente, pulverizada (8,16 kg), sendo submetida à maceração com metanol, resultando no extrato bruto (EBPB – 1,66 kg). Em seguida, o EBPB foi particionado com hexano, clorofórmio e acetato de etila, resultando nos extratos hexânico (EHPB – 150,00 g), clorofórmico (ECPB - 291,11 g) e acetato de etila (EAPB – 4,2 g).

Obtenção das frações

O EAPB foi submetido a CC com sílica gel 60H e, como fase móvel, sistema de gradiente com diclorometano:metanol, variando do menos polar para o mais polar, resultando em 17 frações (FAPB01-FAPB17). Para o ECPB foi utilizado hexano:acetato de etila como fase móvel, resultando em 20 frações (FAPB01-FAPB17).

Determinação do perfil cromatográfico por CLAE-DAD

Os extratos (EBPB; EHPB; ECPB; EAPB) foram avaliados por CLAE-DAD para obtenção do fingerprint

A análise cromatográfica foi realizada por meio de coluna LiChroCART Purospher StaR® RP18-e (250 mm x 4,6 mm i.d.) (5μm) (Merck®, Darmastad, Germany) combinado com pré-coluna apropriada da Merck®. As condições cromatográficas incluíram: volume de injeção de 20µL, faixa de comprimento de onda de 220-600 nm.

A fase móvel foi composta por solução de ácido acético 0,7% (A) e acetonitrila:ácido acético 0,7% (8:2) (B) em sistema de gradiente: 0-1 min, 95% A; 1-5 min, 95-90% A; 5-12 min, 90-83% A; 12-20 min 83-56%A; 20-30 min, 5620% A; 30-30:01 20-0%A; 30:01-35 min, 100% B.

Os extratos foram dissolvidos com a fase B (10 mg/mL) e filtrados em cartucho de extração de fase sólida C18 (Cleanert®) e filtro de membrana de éster de celulose 0,45 μm (Millipore®), sendo posteriormente submetidos a cromatógrafo Varian e detector de arranjo de diodo Varian ProStar.

Teor de flavonoides totais

O teor de flavonoides totais foi realizado com base na metodologia descrita por POTHITIRAT et al. (2009). A quercetina (10 a 60 µg/mL) foi utilizada como padrão para construção da curva de calibração, enquanto as amostras (EHPB; ECPB; EAPB) foram preparadas na concentração de 0,5 mg/mL, utilizando metanol como solvente.

O resultado foi expresso em mg de quercetina equivalente (QE) por g de extrato.

Atividade antioxidante

A avaliação da atividade antioxidante foi realizada pelo método de sequestro do radical livre DPPH•, de acordo com a metodologia adaptada descrita por MALTERUD et al. (1993).

Inicialmente, o teste foi realizado com os extratos (EBPB; EHPB; ECPB; EAPB) em soluções etanólicas de 10,0 mg/mL. Após a obtenção desses resultados, o extrato mais ativo foi selecionado para dar continuidade ao estudo. Assim, o EAPB foi avaliado, em diferentes concentrações (2,0 a 10,0 mg/mL) para determinação da concentração efetiva para sequestrar 50% dos radicais livres DPPH• (CE50). Além disso, para parâmetro de comparação foram avaliados o extrato padronizado de Ginkgo biloba (EGb761) (0,75 a 5,00 mg/mL) e propilgalato (0,05 a 0,40 mg/mL) e determinadas as respectivas CE50

As FAPB também foram submetidas ao teste para avaliar qual delas tinha maior potencial de inibição do radical livre DPPH•. Para isso foram preparadas soluções etanólicas de 10,0 mg/mL, sendo que para as frações mais ativas foram determinadas as CE50. Assim, para FAPB10 e FAPB13 foram utilizadas as concentrações de 1 a 7 mg/mL; e para FAPB15, as concentrações foram de 0,5 a 7 mg/mL.

A atividade antioxidante foi expressa em porcentagem e calculada através da Equação 1.

Equação 1 – Cálculo da porcentagem de sequestro de radical livre DPPH• %������ = 100(��0−����) ��0��−������

Fonte: MALTERUD et al., 1993.

Em que A0 = absorbância inicial da solução de DPPH•; Af = absorbância final da amostra após reação de 15 minutos com DPPH•; A0p = absorbância inicial do padrão e Ap = absorbância final do padrão após reação de 15 minutos com DPPH•.

Letalidade frente à Artemia salina

O teste de letalidade frente à Artemia salina (TAS) foi baseado no método desenvolvido adaptado por SERRANO, ORTEGA e VILLAR (1996).

Inicialmente, o teste foi realizado com os extratos (EBPB; EHPB; ECPB; EAPB) em concentrações que variaram de 10 a 1000 µg/mL. Após a obtenção da concentração letal para 50% dos nauplii (CL50), o extrato mais ativo foi selecionado para dar continuidade ao estudo. Nesse sentido, as FCPB foram avaliadas na concentração de 10 µg/mL e as mais ativas tiveram o teste repetido para determinação da CL50. Foram utilizadas concentrações entre 0,5 e 10 µg/mL para a FCPB04 e 8,5 a 50 µg/mL para a FCPB11.

A porcentagem de letalidade frente à Artemia salina (%LAS), em cada concentração, foi determinada como uma média aritmética dos valores encontrados nas três replicatas. Os nauplii foram considerados mortos caso não exibissem

nenhum movimento durante dez segundos de observação. Nos testes que ocorreram morte no branco, os dados foram corrigidos usando a fórmula de correção.

Equação 2 – Cálculo da porcentagem de letalidade frente à Artemia salina %������=(��°������������������������������−��°��������������������������������) ��°���������������������������������������������� ��100

Fonte: SERRANO; ORTEGA; VILLAR (1996).

Atividade anticolinesterásica

A avaliação da atividade anticolinesterásica foi realizada de acordo com o teste de ELLMANN et al. (1961) com adaptações.

O teste foi realizado com os extratos (EBPB; EHPB; ECPB; EAPB) em solução etanólica de 1 mg/mL. Após a obtenção desses resultados, o extrato mais ativo (FCPB) foi selecionado para dar continuidade ao estudo. E como padrão foi utilizada solução etanólica de eserina a 500 µmol.

A porcentagem de inibição foi calculada, conforme a Equação 3:

Equação 3 – Cálculo da porcentagem de inibição da enzima AChE %������ℎ��=(������−������) ������ ��100

Fonte: ELLMANN et al. (1961) adaptada.

Em que, %IAChE é a porcentagem de inibição da AChE, ΔAb é a diferença de absorbância do branco no tempo de 10 minutos e no tempo inicial, enquanto ΔAi é a diferença de absorbância do inibidor (padrão ou amostra) no tempo de 10 minutos e no tempo inicial.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelos testes de Tukey ou Scott-knott (p<0,05). Foi utilizado também o método de Dunnett (p<0,05) para comparar as amostras com os padrões positivos, bem como avaliar a eficácia do fracionamento para expressão das atividades. Os dados de flavonoides totais, atividade antioxidante e letalidade frente à Artemia salina foram submetidos a análise de regressão linear, sendo considerados valores de r≥0,99.

Resultados e Discussão

Determinação do perfil cromatográfico por CLAE-DAD

Para determinação do fingerprint dos extratos, foram avaliados em diferentes comprimentos de onda, sendo estes: 220, 280, 320, 380 e 400 nm, pois foi observado que acima de 400 nm, os picos não eram mais visualizados nos cromatogramas. Dessa forma, foi determinado o melhor comprimento de onda para aquisição cromatográfica de 280 nm para os extratos, com exceção do extrato hexânico, que apresentou melhor resolução no comprimento de onda de 320 nm. A determinação do comprimento de onda foi realizada com base no número e resolução dos picos.

De acordo com PRADO (2012), o perfil cromatográfico de um extrato vegetal pode representar a complexidade química da amostra, levando em conta as restrições em relação ao método específico escolhido, bem como as limitações do detector utilizado.

Os cromatogramas dos extratos EBPB (8 picos), EAPB (8 picos) e ECPB (11 picos) apresentaram mais picos, nos quais foram possível visualizar espectro no UV bem definidos, do que o cromatograma do EHPB (2 picos) (Figura 1), o que pode estar relacionado com as limitações do método, tendo em vista a utilização do detector de DAD, o qual permite a detecção de substâncias que apresentem grupos cromóforos, como os flavonoides (LEITE, 2009). Tais substâncias são

comumente encontradas em extratos mais polares, justificando assim a diferença do perfil cromatográfico do extrato hexânico quando comparado aos demais extratos (CECHINEL FILHO, V.; YUNES, 1998).

Figura 1 – Cromatogramas dos EBPB, EAPB e ECPB em 280 nm e EHPB em 320 nm

Alguns trabalhos que realizam a análise por CLAE-DAD como fingerprint costumam utilizar a faixa de análise de 190-400 nm (YANG et al 2013). E dentre as substâncias relatadas, encontram-se os ácidos fenólicos e flavonoides (COELHO, 2013), quinonas (RIBEIRO, 2011) e cumarinas (OWITI, 2011).

Os espectros no UV obtidos na análise dos extratos de P. boliviensis apresentam de uma a três bandas, na faixa de 220 a 360 nm. De acordo com a literatura, os ácidos fenólicos podem apresentar uma única banda, a exemplo do ácido phidróxi-benzoico, como λmáx de 282; ou duas bandas entre 200-300 nm, como o ácido vanílico, com λmáx 258 e 294 nm (TERMENTZI; KEFALAS; KOKKALOU, 2008). Já os flavonoides costumam apresentar espectros com duas bandas, normalmente na faixa de 240-285 nm e 300-400 nm, variando a depender da classe e do padrão de substituição (ZUANAZZI, 2002). Enquanto as cumarinas podem apresentar de duas a três bandas, sendo, uma entre 200-300 nm e outra acima de 300 nm, para as que apresentam duas bandas, e mais uma entre 200-300 nm, para as que apresentam três bandas (FONSECA, 2009).

Sendo assim, a análise dos espectros no UV obtidos possibilita sugerir a presença de substâncias da classe dos fenólicos, tais como ácidos fenólicos e flavonoides, principalmente, bem como possíveis cumarinas, sendo essas substâncias comumente encontradas em espécies de Polygala (LACAILLE-DUBOIS; DELAUDE; MITAINE-OFFER, 2020).

Teor de flavonoides totais

Os valores de flavonoides totais (Tabela 1) corroboram com os resultados obtidos nas análises por CLAE-DAD, visto que os extratos ECPB e EAPB apresentaram diversos picos, sendo alguns desses com espectros de UV característicos de flavonoides, enquanto o EHPB apresentou poucos picos, sendo que nenhum desses apresenta espectro correspondente a compostos flavonoídicos.

Tabela 1. Resultado do teste de flavonoides totais e atividade antioxidante pelo método de sequestro do radical livre DPPH• dos extratos de Polygala boliviensis

Amostra

Teste

Flavonoides totais (mg QE/g de extrato)

DPPH• % SRL

EBPB nt 66,05±2,33a

EHPB - 10,36±0,89b

ECPB 16,6±0,03 29,98±1,09c

EAPB 55,9±0,03 89,72±1,13d

Resultados expressos em média ± desvio padrão; (-) Não detectado; nt: amostra não testada. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).

Estudos realizados por MENDES (2008) detectaram valores de 0,11 mg QE/ g de extrato seco para o extrato hexânico e de 0,14 mg QE/g de extrato seco para o extrato acetato de etila de Polygala sabulosa. É possível avaliar, então, que o extrato acetato de etila da P. boliviensis apresentou maior teor de flavonoides totais do que a P. sabulosa. No entanto, MENDES (2008) conseguiu detectar flavonoides no extrato hexânico, diferente dos resultados obtidos no presente trabalho.

Já SAKTHIDEVI e MOHAN (2012) avaliaram os extratos etanólicos de 3 diferentes espécies do gênero Polygala e encontraram teor de flavonoides totais de 10,1 mg/g de extrato de P. javana; 12,4 mg/g de extrato de P. chinensis; e 9,6 mg/g de extrato de P. rosmarinifolia. Pode-se observar que todas essas espécies de Polygala avaliadas apresentaram valores inferiores de flavonoides totais do que os ECPB e EAPB de P. boliviensis. No entanto, nesse estudo foram avaliados os extratos etanólicos brutos e, com isso os menores teores podem ser justificados, visto que comumente a etapa de partição acarreta o aumento do teor desses metabólitos nos extratos, principalmente, nos obtidos com acetato de etila.

A maior presença de flavonoides totais no EAPB reafirma outros estudos apresentados na literatura, isso porque a partição com o solvente acetato de etila proporciona maior extração de flavonoides do que os outros solventes (hexano e clorofórmio), tendo em vista a presença de hidroxilas fenólicas nessas estruturas, o que aumenta a sua polaridade e maior afinidade com o solvente em questão (CECHINEL FILHO, V.; YUNES, 1998).

Atividade antioxidante

Analisando a Tabela 1, observa-se que o EAPB foi o mais ativo na concentração de 10 mg/mL, sequestrando 89,72% de radicais livres e que o fracionamento proporcionou o aumento da atividade do EAPB e diminuição da atividade para os extratos EHPB e ECPB quando comparados com o EBPB. Nesse sentido, pode-se inferir que os componentes ativos estavam em menores concentrações no EBPB ou sofriam interferência de antagonistas.

Tal resultado, está de acordo com os dados da literatura, em que o fracionamento com acetato de etila implica no aumento da atividade antioxidante expressada, isso porque as substâncias relacionadas a essa atividade, como flavonoides, cumarinas, taninos e outros fenólicos estão em maior concentração nesse tipo de extrato (CECHINEL FILHO, V.; YUNES, 1998).

Os resultados obtidos no teste de flavonoides totais corroboram com os valores obtidos para o teste de DPPH, tendo em vista que o extrato que apresentou maior teor de flavonoides (EAPB) foi também o que apresentou maior atividade antioxidante, seguido do ECPB, que apresentou o segundo maior teor de flavonoides totais (Tabela 1).

Como relatado em literatura, os fenólicos, em especial flavonoides, apresentam alta capacidade antioxidante devido

à sua estrutura química. A presença de anéis aromáticos permite a ressonância dos elétrons, bem como os sítios de quelação de metais contribui, invariavelmente, com essa atividade (RAMALHO; JORGE, 2006).

A tabela 2 mostra que a CE50 encontrada para o EAPB foi inferior ao estudo de LAPA (2006) que encontrou valor de CE50=61,2 mg/mL para o extrato hidroalcoólico de P. paniculata e, apesar do alto valor obtido, relacionou a atividade gastroprotetora do extrato. Já MENDES (2008) encontrou valores de CE50 de, aproximadamente, 0,06 mg/mL para o extrato hidroalcóolico de P. sabulosa e 0,11 mg/mL para o extrato acetato de etila. Enquanto SAKTHIDEVI e MOHAN (2012) obtiveram valores de CE50 equivalentes a, aproximadamente, 0,05; 0,06 e 0,04 mg/mL para P. javana, P. chinensis e P. rosmarinifolia, respectivamente.

Tabela 2. Resultado da atividade antioxidante do EAPB, padrões e FAPB de Polygala boliviensis

Amostra CE50 (mg/mL)

EAPB 4,87±0,13

EGb761 3,28±0,38

Amostra (10 mg/mL) %SRL

FAPB01 nt FAPB02 nt

FAPB03 0,44±1,69a FAPB04 3,42±0,81a

Propilgalato 0,21±0,01 FAPB05 25,50±0,39b FAPB06 2,69±0,61a

FAPB10 4,32±0,19A FAPB07 68,34±1,61d FAPB08 1,71±0,81a FAPB13 3,67±0,34A FAPB09 84,42±7,05f FAPB10 100,00±2,66h

FAPB14 nt FAPB11 61,90±3,16c FAPB12 96,19±4,11g

FAPB15 4,13±0,21A FAPB13 100,00±4,33h FAPB14 100,00±1,10h FAPB15 100,00±2,08h FAPB16 75,46±1,66e FAPB17 96,34±2,81g

Resultados expressos em média ± desvio padrão. nt: amostras não testadas por falta de massa. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).

Segundo FADDA et al. (2014) fatores como tempo de reação, concentração inicial do DPPH e comportamento cinético das diferentes amostras, influenciam no valor de CE50 obtido, dificultando a comparação de resultados. Nesse sentido, apesar do relato na literatura de estudos com outras espécies do gênero Polygala, a comparação dos resultados é dificultada devido às diferentes formas de execução do teste de sequestro do radical livre DPPH. Dessa forma, os resultados foram comparados com o extrato padronizado de Ginkgo biloba e propilgalato (Tabela 2).

Comparando a CE50 do EGb761 e do propilgalato com o EAPB, pelo teste Dunnett (p<0,05), a diferença é significativa. No entanto, é possível avaliar que o valor de CE50 do EAPB é um valor próximo ao EGb761, que, de acordo com BRIDI, STEFFEN e HENRIQUES (2001) tem sua atividade antioxidante relacionada com os efeitos benéficos desse extrato em doenças neurodegenerativas. Nesse sentido, a atividade apresentada pelo EAPB também pode influenciar na expressão de outras atividades biológicas que apresentam relação com a atividade antioxidante pelo sequestro de radicais livres.

Avaliando as frações resultantes da CC do EAPB (Tabela 2), as frações que apresentaram melhor atividade antioxidante foram FAPB10, FAPB13, FAPB14 e FAPB15, não havendo diferença significativa pelo teste de Scott-Knott (p<0,05), da CE50 das frações FAPB10, FAPB13 e FAPB15.

De acordo com as análises estatísticas, o fracionamento do EAPB proporcionou aumento significativo da atividade antioxidante para essas frações, pois, quando comparados os valores de CE50 do EAPB e frações, houve diferença significativa pelo teste de Dunnett (p<0,05). Vale ressaltar ainda que a fração mais ativa (FAPB13) não apresentou

diferença significativa, pelo teste Dunnett, quando comparada ao EGb761, mostrando-se como uma fração promissora para análise de outras atividades relacionadas com a ação de sequestro de radicais livres.

Letalidade frente à Artemia salina

Em relação à toxicidade frente à Artemia salina, a substância que apresentar CL50 <100μg/mLpodesercomparável com a camptotecina e sulfato de vincristina, duas substâncias consideradas muito ativas, e aquela que apresentar CL50 no intervalo de 100 a 900 μg/mL pode ser comparada ao ácido hipúrico e considerada medianamente ativa (DAVID; SILVA; MOURA, 2001).

Observando a CL50 obtida para os extratos de P. boliviensis (Tabela 3), é possível classificar os extratos EHPB e ECPB com muito ativos, enquanto os extratos EBPB e EAPB podem ser classificados como medianamente ativos. Podese observar ainda, que houve um aumento significativo, utilizando o teste Dunnett (p<0,05), da letalidade com o fracionamento do extrato, sendo que todos os extratos resultantes da partição apresentaram CL50 menor do que o EBPB. Tabela 3. Resultado da letalidade frente a Artemia salina dos extratos e FCPB de Polygala boliviensis

Amostra CL50 (µg/mL) Amostra (µg/mL) %LAS

EBPB 186,69±4,21 A

FCPB01 nt FCPB02 nt FCPB03 nt

FCPB04 74,39±2,22 a FCPB05 nt FCPB06 27,33±1,13 b ECPB 51,54±0,38 C FCPB07 23,47±0,14 b FCPB08 14,42±0,21 b FCPB09 23,10±1,72 b EAPB 101,10±4,09 D FCPB10 32,90±1,41 b FCPB11 57,34±1,31 a FCPB12 31,69±2,63 b

EHPB 81,46±0,28 B

FCPB04 6,60±1,33AA FCPB13 27,94±0,75 b FCPB14 3,25±0,66 b FCPB15 31,69±1,41 b

FCPB11 31,50±1,66BB

FCPB16 17,83±1,83 b FCPB17 6,79±0,96 b FCPB18 2,72±0,83 b FCPB19 14,26±1,68 b FCPB20 31,98±2,25 b

Resultados expressos em média ± desvio padrão. nt: amostras não testadas por falta de massa. Médias seguidas por letras maiúsculas iguais não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05). Médias seguidas por letras minúsculas iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05).

MONTANHER, PIZZOLATTI e BRIGHENTE (2003) testaram o extrato hidroalcoólico de P. paniculata e encontraram CL50 de 1396 µg/mL, enquanto para o extrato hidroalcoólico de P. sabulosa foi encontrado valor de 692 µg/mL. Ao fracionar o extrato de P. sabulosa, os autores também observaram o aumento da atividade para os extratos hexânico (661 µg/mL) e diclorometano (652 µg/mL), no entanto houve diminuição da atividade para o extrato acetato de etila (>1000 µg/mL).

MISSAU (2008) encontrou também uma maior atividade para os extratos diclorometano (776,25 µg/mL) e hexânico (741,31 µg/mL), quando comparados aos extratos bruto (954,65 µg/mL) e acetato de etila (975,25 µg/mL) de P. paniculata. Já para P. pulchella dentre os extratos analisados, apenas o extrato etanólico das flores apresentou-se ativo, com CL50 de 371,53 µg/mL.

É possível analisar que nos estudos, os extratos de espécies de Polygala apresentaram atividade no TAS, sendo que as frações que se destacam são, principalmente, as hexânicas e diclorometano, concordando com o presente estudo, no

qual os extratos mais ativos também foram os extratos hexânico e clorofórmio, o que pode ser justificado pela presença de substâncias com maior afinidade por esses solventes que apresentam também maior toxicidade.

De acordo com a análise estatística realizada com as frações obtidas da CC do ECPB, a FCPB04 e a FCPB11 foram as mais ativas, não diferenciando-se entre si na triagem (Tabela 3). No entanto, comparando a CL50, os resultados diferenciam entre si pelo teste Tukey (p<0,05), sendo FCPB04 mais ativa (Tabela 3). Comparando os valores de CL50 das frações mais ativas com o extrato clorofórmio, observa-se também que há diferença significativa pelo teste Dunnett (p<0,05), indicando que o fracionamento levou ao aumento da letalidade das frações.

Estudos fitoquímicos já realizados com extrato de plantas e substâncias isoladas de espécies de Polygala (P. vulgare; P. senega; P. sabulosa) demonstraram alto potencial citotóxico e boa atividade antitumoral contra diversas células cancerígenas. Dentre as substâncias isoladas que apresentaram toxicidade, destacam-se as lignanas, xantonas e cumarinas (DALL’ACQUA et al , 2002; MENDES, 2008; PAUL et al.,2010).

Dessa forma, os resultados de alta letalidade do ECPB, bem como das FCPB04 e FCPB11 concordam com o que já é descrito na literatura, tendo em vista que, a partição do extrato metanólico bruto com clorofórmio possibilita a extração de cumarinas e estirilpironas (CECHINEL FILHO; YUNES, 1998), as quais já foram isoladas e com atividade citotóxica comprovada em outras espécies de Polygala

Atividade anticolinesterásica

Avaliando os extratos de P. boliviensis com relação à atividade anticolinesterásica, com exceção do ECPB que apresentou atividade pelo método utilizado, como inibição de 18,83±2,12 %, os demais extratos não apresentaram inibição da AChE (Tabela 4).

De acordo com VINUTHA et al. (2007), os extratos que apresentam inibição menor do que 30% podem ser considerados inativos ou com baixa atividade, os que apresentam inibição entre 30 e 50% podem ser considerados medianamente ativos e, acima de 50% são considerados potentes inibidores.

Dessa forma, pode-se concluir que o ECPB ser considerado como um fraco inibidor. No entanto, o fracionamento proporcionou o aumento da inibição da AChE pelas frações testadas, sendo que todas podem ser consideradas como potentes inibidores, apesar de apresentarem diferença significativa quando comparados com o padrão eserina pelo teste Dunnett (p<0,05) (Tabela 4).

A diferença de inibição da AChE pelo ECPB e suas frações pode estar relacionada a separação de substâncias presentes nas frações que não foram testadas. Estas podem diminuir a atividade das substâncias presentes nas demais frações por antagonismo. Além disso, o aumento da concentração das substâncias ativas nas frações testadas, permitiram que expressassem a inibição da enzima AChE.

Estudos apontam que a classe de substâncias com maior potencial anticolinesterásico é a dos alcaloides, no entanto, existem relatos de outras classes que apresentam tal atividade. QUEIROZ (2013) relatou que além dos alcaloides, terpenoides e polifenois também podem apresentar atividade anticolinesterásica. Já VIEIRA (2010) avaliou a atividade expressada com cumarinas sintéticas.

Tabela 4. Resultado da atividade anticolinesterásica dos extratos e FCPB de Polygala boliviensis Amostra (1 mg/mL) %IAChE

EBPBEHPBECPB 18,83±2,12 EAPBFCPB01 nt FCPB02 nt FCPB03 nt FCPB04 62,29±0,24 a FCPB06 65,42±0,78 a FCPB07 58,60±0,02 b FCPB08 74,22±0,46 c FCPB09 69,44±1,59 d FCPB10 63,89±1,10 a FCPB11 60,93±0,28 a FCPB12 65,01±5,07 a FCPB13 53,93±1,61 b FCPB14 57,55±0,02 b FCPB15 63,52±0,03 a FCPB16 56,06±2,22 b FCPB17 55,13±4,70 b FCPB18 50,60±0,25 a FCPB19 51,28±2,99 e FCPB20 56,73±3,30 e Eserina 94,28±0,56

Resultados expressos em média ± desvio padrão; (-) Não detectado; nt: amostras não testadas por falta de massa. Médias seguidas por letras iguais não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott (p<0,05)

Nesse sentido, é possível que as frações analisadas apresentem componentes pertencentes a essas classes de metabólitos secundários citadas anteriormente, e que, consequentemente, acarretaram a alta atividade anticolinesterásica dessas frações. Estudos com outras espécies de Polygala, como a P. tenuifolia, espécie utilizada no tratamento de problemas de memória, indicam que a inibição da AChE é uma das suas principais formas de ação (LI et al., 2014).

Conclusão

A Polygala boliviensis apresentou frações com importante ação antioxidante e anticolinesterásica, além da letalidade frente à Artemia salina, sendo este teste relacionado na literatura com diferentes atividades, como antimicrobiana, antifúngica, antiparasitária e antitumoral.

Foi possível traçar o perfil químico da espécie por CLAE-DAD, constatando a riqueza dos extratos de P. boliviensis em ácidos fenólicos, flavonoides e cumarinas; além de avaliar o teor de flavonoides totais da espécie, destacando-se o extrato em acetato de etila que também apresentou importante atividade antioxidante.

A P. boliviensis é pouco estudada dos pontos de vista químico e biológico, sendo assim, esse trabalho fornece resultados inéditos acerca desta espécie, servindo de suporte para o desenvolvimento de novas pesquisas sobre o tema, que possam aprofundar e complementar os resultados encontrados.

Nesse sentido, os resultados deste trabalho, atrelados aos dados descritos na literatura, mostram a riqueza proveniente dos vegetais, em especial, as espécies da flora brasileira e do bioma caatinga, afirmando que as plantas medicinais são fontes de diferentes compostos ativos biologicamente que poderão dar origem ou servir de protótipo para o desenvolvimento de novos produtos terapêuticos.

Agradecimentos

Às agências CNPq, FAPESB e CAPES pelo apoio financeiro.

Referências

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Chemical analysis and evaluation of antioxidant, antiacetylcholinesterase activity and Artemia salina lethality by Asemeia ovata (Polygalaceae)

Abstract

The Asemeia genus is composed of 28 American species, some of which are found in Bahia semi-arid region. The objective of this study is to describe the chemical and biological profile of Asemeia ovata. The extracts were subjected to HPLC-DAD and tests for determining the total flavonoid (aluminum chloride) and phenolic content (Folin Ciocalteau). For the evaluation of antioxidant, antiacetylcholinesterase activity and lethality, the scavenging activity of DPPH techniques, adaptation of Ellman method and Artemia salina method were applied respectively. The chemical profile showed that the extracts are rich in phenolic compounds. The antioxidant activity evaluation showed results that varied from 5.46 mg/mL to 13.21 mg/mL. Evaluation of antiacetylcholinesterase activity did not show positive results (8.68%15.35). The extracts showed lethality (162.08 mg/mL-71.91 mg/mL). The results suggest A. ovata as a promising plant for the realization of new chemical and biological studies leading to the isolation of the bioactive compounds.

Keywords: acetylcholinesterase; biological activities; chromatography; DPPH; fingerprint.

Resumo

(Análise química e avaliação da atividade antioxidante, antiacetilcolinesterásica e letalidade de Artemia salina por Asemeia ovata (Polygalaceae)). O gênero Asemeia é composto de 28 espécies, algumas das quais são encontradas no semiárido baiano. O objetivo deste estudo é descrever o perfil químico e biológico da espécie Asemeia ovata. Os extratos foram submetidos a CLAE-DAD e testes para determinação do teor de flavonoides totais (cloreto de alumínio) e fenólicos (Folin Ciocalteau). Para a avaliação da atividade antioxidante, antiacetilcolinesterase e letalidade, foram aplicadas as técnicas de DPPH, adaptação do método de Ellman e método de Artemia salina, respectivamente. O perfil químico mostrou que os extratos são ricos em compostos fenólicos. A avaliação da atividade antioxidante mostrou resultados que variaram de 5,46 mg/mL a 13,21 mg/mL. A avaliação da atividade antiacetilcolinesterase não apresentou resultados positivos (8,68%-15,35%). Os extratos apresentaram letalidade (162,08 mg/mL-71,91 mg/mL). Os resultados sugerem A. ovata como uma planta promissora para a realização de novos estudos químicos e biológicos que levem ao isolamento dos compostos bioativos.

Palavras-Chave: acetilcolinesterase; atividade biológica; cromatografia; DPPH; fingerprint

1 Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana, Avenida Luiz Eduardo Magalhães, S/N, CEP 44079-002, Feira de Santana, BA, Brasil, Email: luizcarneiro86@gmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: dfsilva@uefs.br

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: igor.kennedy@gmail.com

4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: diegocost@live.com

5 Universidade Federal de Santa Catarina, Rod. Ulysses Gaboardi km 3, Campus de Curitibanos – Curitibanos, CEP 89520-000, Santa Catarina, Brasil, E-mail: jfpastore@hotmail.com

6 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cleiroz@gmail.com

7 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.br

Introduction

Currently, the family Polygalaceae Hoffmanns & Link comprises 27 genera and about 1,300 species (PASTORE; SILVEIRA, 2016) which are widely distributed throughout the world (MARQUES; PEIXOTO, 2007; FURNESS; STAFFORD, 1995). The genus Asemeia Raf. ex Small has neotropical distribution, and comprises 28 species, most of them with seasonal occurrence in savannas or less frequently in boards or inside forest vegetation (PASTORE; ABBOTT, 2012).

Studies in Polygalaceae demonstrate the presence of several compounds including coumarins, xanthones, flavonoids and steroids (MEOTTI et al., 2006, LAPA et al., 2006). In addition, another study also quantified the methyl salicylate in different genera and species of this family, with a possible contributor to the antinociceptive activity exhibited by some species (ROCHA et al., 2012). Besides, members of this family are also known to contain chemical compounds which exhibit analgesic activity, expectorant, sedative, antifungal, and others (LAPA, 2006). However, in general, members of Polygalaceae have medicinal potential which was not deeply explored and considering its diversity and ordinary occurrence in Brazilian vegetation, it makes Polygalaceae ideal for bioprospective projects and comparative studies among species or genera (AGUIAR; ARANHA FILHO, 2008).

Although the known potential relevance of this family, only a few chemical and biological studies are available and none of them include Asemeia ovata (Poir.) J.F.B.Pastore & J.R.Abott. Asemeia ovata is a widely-distributed species, occurring from Central America to Mato Grosso do Sul States in Brazil. Despite the wide distribution, this species is more frequent in areas of Brazilian semiarid with sandy soils.

Finally, the aim of this study was to establish the phytochemical profile using High Pressure Liquid Chromatography with Diode-Array Detector (HPLC-DAD). In addition, it sought to evaluate the antioxidant and antiacetylcholinesterase activity in vitro and its lethality on the microcrustacean Artemia salina

Experimental

Plant material

Asemeia ovata was gathered in the area of the State University of Feira de Santana, (Short in Portuguese UEFS) located in Feira de Santana city, state of Bahia, Brazil, in August 2013. The identification was made by comparing the gathered material with the voucher specimen (168952 HUEFS) deposited in the Herbarium of the Biology Department of State University of Feira de Santana by the taxonomic expert in the family José Floriano B. Pastore.

Preparation of extracts

All plant material gathered (whole plant) was dried, grinded into powder and subjected to maceration using methanol extraction technique with solvent exchange every 3 days, repeated 5 times. The solvent was evaporated on rotatory evaporator at 50 °C, yielding the dried crude extract (404.8 g - 13.9 %). Approximately 3g of the crude extract was separated to perform the tests, and the remainder was partitioned with organic solvents of different polarities (hexane, chloroform and ethyl acetate). The solvents were evaporated to obtain the hexane extracts (HE): 62.31 g (15,33%); chloroform (CE): 33.97 g (8,39%) and ethyl acetate (EE): 15,09 g (3,73%).

Fingerprint

The analyses were performed using a Varian chromatograph with diode array detector Varian ProStar. The chromatographic separation was performed by column LiChroCART Purospher StaR® RP18-e (250 mm x 4.6 mm i.d.) (5μm) (Merck, Darmastad, Germany) combined with an appropriate pre-column from Merck. The elution gradient used was 0.7% acetic acid solution and acetonitrile (MeCN): 0.7% acetic acid (8:2) (Table 1). The chromatographic conditions included: flow rate of 1 mL/min, injection volume of 20 μL, wavelength range 220-600 nm. The chromatograms were compared at different wavelengths, as were the number of peaks and resolution.

Table 1. Gradient elution used for fingerprint analysis

Time (min) Acetic Acid % Acetic Acid + MeCN %

0:00 95 5 1:00 95 5 5:00 90 10 12:00 83 17 30:00 20 80

Determination of total phenolic and flavonoid

The phenolic contents of extracts were determined by the Folin Ciocalteu colorimetric method with modifications (GEORGÉ et al., 2005). Briefly, aliquots of 10 mg of extracts samples were, respectively, dissolved in 10 ml distilled water. This solution (0.5 ml) was mixed with 2 ml of 7.5% sodium carbonate (Na2CO3) and 2.5 ml of Folin–Ciocalteau reagent. The reaction mixture absorbance was measured at 760 nm (BEL Photonics, Model 1105). Gallic acid standard was used to build a calibration curve and results were expressed in mg equivalent gallic acid (EGA)/100 g of extract.

The total flavonoid content was determined according to the aluminum chloride colorimetric method. Samples of the extracts were prepared in methanol solutions. The absorbance was performed at 415 nm on spectrophotometer (BEL Photonics, Model 1105) and from the results a calibration curve was built with the standard quercetin, whose equation was used to calculate the total flavonoid content. The flavonoid content was expressed in g of equivalents quercetin (EQ)/100 g extract (POTHITIRAT et al., 2009).

Evaluation of antioxidant activity

The antioxidant activity of the extracts was performed by testing the scavenging of free radical 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl (DPPH) (MALTERUD et al., 1993). Then solutions were prepared of the crude methanolic extract, hexane, chloroform and ethyl acetate in various concentrations.

To perform the test, 3 mL aliquot of the methanol solution of DPPH (45 μg/mL) was taken and 50 µL of the sample was added. The propyl gallate was used as a positive control (5 mg/mL). The reaction was monitored by UV-VIS, with λ = 517 nm on spectrophotometer (BEL Photonics, Model 1105), the absorbance being evaluated at 0 and 15 minutes. Readings were performed in triplicate.

The scavenging activity of DPPH by the sample was calculated in percentage, from the following formula: % scavenging of DPPH = 100 (At0 – At15) / (At0p – At15p), where At0 = initial absorbance of the sample; At20= final absorbance of the sample; At0s = standard initial absorbance and At20s = standard of the final absorbance. A graph was plotted correlating the mean values of % of DPPH scavenged versus the concentrations tested of the A. ovata extract, using 95% confidence interval. Using linear regression of graph points, the straight-line equation was derived which was used to calculate the EC50.

Antiacetylcholinesterase Activity

A method developed by Ellman (ELLMAN et al., 1961) adapted by Rahman (RAHMAN et al., 2001) was used for the evaluation of antiacetylcholinesterase activity. The method which is based on the reaction of thiocholine with 5,5'dithio-bis- (2-nitrobenzoic acid) to form a yellow color product. Then, they were deposited in the wells of the microplate 140 µL of phosphate buffer (pH 7.5), 20 µL of the enzyme acetylcholinesterase (0.5 U/ml) and 20 µL of the extracts to be tested (1 mg/mL). The plate was then incubated at room temperature for 15 minutes and then added to this 10 µL of 55'-dithiobis [2-nitrobenzoic acid] (10 mM) and 10 µL of acetylthiocholine iodide (15 mM). The absorbance was measured at 405 nm in an ELISA MultiskanTM GO 3.2. The results were compared with the commercial standard Eserine (physostigmine).

Artemia salina Lethality

In assessing the lethality, approximately 10 naupliis of Artemia salina were transferred to flasks containing artificial seawater and the extracts in five different concentrations. The tests were made in triplicate. The counting of the dead and live animals was performed after 24 h (MEYER et al., 1982; SERRANO; ORTEGA; VILLAR, 1996). LC50 was determined using the lethality of the naupliis of A. salina in contact with crude extracts and fractions (hexane, chloroform and ethyl acetate) of A. ovata.

Results e Discussion

Chemical Analysis

The methanolic extracts (ME), chloroform (CE) and ethyl acetate (EE) showed better resolution of the chromatograms at 280 nm, while the hexane extract (HE) performed at 250 nm (Figure 1). Chromatographic analysis showed variation in the profile of all extracts. The presence of several phenolic compounds, mainly phenolic acids (λmax = 220-290 nm and λmax = 330 approx.) (TERMENTZI; KEFALAS; KOKKALOU, 2008) and flavonoid compounds (λmax = 240-285 nm and λmax = 300-400 nm) (Zuanazzi 2000) in crude, chloroform and ethyl acetate extracts (Figure 2) were observed. Spectra with the characteristic of flavonoids was detected in the hexane extract, but due to the nature of the extract, it is suggested that they are methoxylated flavonoids. In a study of the Polygala japonica species, the fingerprint could also identify the presence of flavonoids (HONG-LAN et al., 2010).

Figure 1. Comparison of the chromatograms at various wavelengths of (A) EBAO, (B) ECAO, (C) EAAO and (D) EHAO. Fonte: own authorship

Figure 2. Chromatogram and UV spectra characteristic of Asemeia ovata. Fonte: own authorship

The total phenolic content obtained by the Folin Ciocalteu method for ME was 12.37 g/100 g. Values were obtained for CE, HE and EE 5.82 g/100 g, 1.69 g/100 g and 2.95 g/100 g, respectively. In the quantification of total flavonoids, the values for ME, CE and EE were obtained. However, the HE did not present sufficient levels to be detected by the used technique. Thus, 2.34 g/100 g for ME, 1.39 g/100 g in CE and 0.93 g/100 g for EE was obtained (Table 2).

Table 2. Content of metabolic classes valued at Asemeia ovata Extract Total flavonoids (g QE/100g) Total phenols (g AGE/100g)

Crude 2.34 2.95 Hexane - 1.69 Chloroform 1.39 5.82 Acetate 0.93 12.37

The phenolic and total flavonoid content showed superior results to those found with other species of the family. The crude extract of P. sabulosa, for example, contains about 0.00164 g/g of gallic acid of the phenolic content in dry extract, while the hexane extract and the ethyl acetate had approximately 0.00143 and 0.00160 g of gallic acid/g of dry extract, respectively (MENDES, 2008).

Antioxidant, antiacetylcholinesterase activity and Artemia salina lethality

The EC50 was found to ME of 9.46 mg/L to CE was 9.16 mg/mL, to HE was 13.21 mg/mL, and EE was 5.46 mg/mL (Table 3). A study of the hydro-alcoholic extract of P. paniculata showed that the antioxidant activity in EC50 is 61.2 mg/mL (LAPA et al., 2007). It is observed that A. ovata, in turn, performs better antioxidant activity.

The Antiacetylcholinesterase activity test showed percentage inhibition (% I) for ME 8.68, and 15.35 to EE. HE and CE showed no activity compared to standard Eserine. Therefore, due to lower results in the evaluation test, when compared with standard Eserine, the species under study did not show significant potential.

The lethality bioassay indicated LC50 equal to 162.08 mg/mL for ME, and equal to 93.25 g/mL, 90.77 mg/mL and 71.91 mg/mL for HE, CE and EE, respectively. The results of the brine shrimp lethality bioassay suggests that all extracts showed toxicity (MAYER, 1982 cited RIBEIRO et al., 2014), it considers that exhibit toxic extracts LC50 less than 1000 µg/mL, making them potential providers of a cytotoxic agent.

Table 3. Details of the biological activities evaluated in Asemeia ovata Extract Antioxidant Activity (CE50-mg/mL) Anticholinesterasic Activity (%I) Lethality (CL50-μg/mL)

Crude 5.46 8.68 162.08 Hexane 13.21 - 93.25 Chloroform 9.16 - 90.77 Acetate 9.46 15.35 71.91

Study with Asemeia extraaxilaris presented LC50 for crude ethanol extract of 242.23 g/mL, the fractions hexane, chloroform and ethyl acetate presented, 289.17 µg/mL, 248.22 µg/mL and 232.37 µg/mL, respectively (SILVA, 2014).

Conclusion

The results of this study showed that Asemeia ovata species presents a variety of compounds especially phenolic compounds, mainly phenolic acids and flavonoids. Therefore, this species has potential antioxidant activity, especially when compared to other species of the family. The lethality of extracts in the Artemia salina makes this a source of interest for future studies both for evidence of toxicity, providing potential cytotoxic agents, and even potential for related activities such as antimicrobial potential, parasiticide, trypanocidal and antimalarial.

Acknowledgements

Universidade Estadual de Feira de Santana, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (Fapesb) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Referências

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Conservação e domesticação de Lippia Linn. (Verbenaceae): a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana

Resumo

O gênero Lippia tem sido pesquisado intensamente devido ao potencial medicinal de suas espécies. Na medicina popular as espécies do gênero são utilizadas no tratamento de diversas doenças, principalmente em desordens gastrointestinais e respiratórias. Pesquisas têm comprovado a atividade biológica e ações medicinais dos metabólitos secundários produzidos pelo gênero. Desse modo, são de extrema importância pesquisas voltadas para a conservação e domesticação dessas espécies. Este estudo teve como objetivo realizar um levantamento bibliográfico das pesquisas desenvolvidas com o gênero Lippia, nos últimos 20 anos, enfatizando a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). Os trabalhos acadêmicos foram extraídos das bases de dados SciELO, Plataforma Periódicos CAPES, ScienceDirect e Biblioteca de teses e dissertações, utilizando-se os termos Lippia, Conservation, Cultivation, Domestication. Também foram levantados os registros de coleta no Herbário da UEFS (HUEFS), artigos, teses e dissertações produzidas na instituição. Foram encontrados 74 artigos desenvolvidos com o gênero Lippia, 1308 registros no herbário e 24 teses e dissertações. Os dados encontrados confirmam a importância do gênero Lippia, indicada pelo alto número de estudos realizados, bem como demonstram as ações da Universidade Estadual de Feira de Santana nas áreas da domesticação e conservação desse gênero.

Palavras-Chave: plantas medicinais; Recursos Genéticos Vegetais; caracterização de germoplasma; cultivo.

Abstract

(Conservation and domestication of the Lippia Linn. (Verbenaceae): the contribution of the State University of Feira de Santana) The genus Lippia has been intensively researched due to the medicinal potential of its species. In folk medicine, species of the genus are used in the treatment of several diseases, mainly in gastrointestinal and respiratory disorders. Research has proven the biological activity and medicinal actions of secondary metabolites produced by the genus. Thus, research aimed at the conservation and domestication of these species is extremely important. This study aimed to carry out a bibliographic survey of research carried out with the genus Lippia, in the last 20 years, emphasizing the contribution of the State University of Feira de Santana (UEFS). The academic works were extracted from the SciELO databases, Plataforma Periódicos CAPES, ScienceDirect and Library of theses and dissertations, using the terms Lippia, Conservation, Cultivation, Domestication. Collection records at the UEFS Herbarium (HUEFS), articles, theses and dissertations produced at the institution were also collected. We found 74 articles developed with the genus Lippia, 1308 herbarium records and 24 theses and dissertations. The data found confirm the importance of the genus Lippia, indicated by the high number of studies carried out, as well as demonstrate the actions of the State University of Feira de Santana in the areas of domestication and conservation of this genus.

Keywords: medicinal plant; Plant Genetic Resources; characterization of germplasm; cultivation.

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: marilucigonzaga@gmail.com

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: lenaldo.uefs@gmail.com

Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: emillyfeijo@hotmail.com

Introdução

O gênero Lippia Linn. (Verbenaceae) reúne cerca de 200 espécies de ervas, pequenas árvores e arbustos, distribuídas em países localizados na África Tropical, Américas do Sul e América Central (RESENDE et al., 2015). Existem três grandes centros de diversidade do gênero, sendo o Brasil o maior deles, com 111 espécies, seguido por México e Argentina (SALIMENA; MULGURA, 2015) No Brasil merece destaque a Cadeia do Espinhaço, localizada nos estados de Minas Gerais, Bahia e Goiás, por concentrar o maior número de espécies do gênero, distribuídas nos biomas cerrados e caatinga (COSTA et al., 2017).

As espécies do gênero Lippia Linn. apresentam uma diversidade de compostos bioativos, que estão presentes principalmente nos óleos essenciais, oriundos do metabolismo secundário. Constituídos de compostos voláteis, os óleos essenciais são formados predominantemente por mono e sesquiterpenos, responsáveis por diversas atividades biológicas do gênero (OLIVEIRA et al., 2018). Pesquisas científicas têm confirmado atividade antibacteriana, antifúngica, antiviral e antitumoral para o gênero (COSTA et al., 2017).

Contudo, com os avanços ocorridos na agricultura e urbanização, as áreas de vegetações nativas carecem do desenvolvimento de estratégias que conciliam o crescimento econômico e uso sustentável dos recursos naturais, para garantia de sua conservação (LAMARCA; OLIVEIRA JUNIOR; BARBEDO, 2020). A retirada indiscriminada dos recursos vegetais, como espécies pertencentes ao gênero Lippia, das áreas de ocorrência natural, tem representado uma ameaça à preservação, visto que essa prática tem provocado a diminuição da variabilidade genética, assim como redução da diversidade biológica das espécies. Dessa forma, estudos direcionados para conservação e domesticação dessas espécies são de suma importância.

A conservação de germoplasma possibilita a manutenção da diversidade genética das espécies, garantindo a sua preservação para uso atual ou futuro (KAHILAINEN et al., 2014). Nesse processo, o fornecimento de informações sobre as coleções de germoplasma é a base para o desenvolvimento estratégico da conservação genética (SOUZA, 2015). Esse conhecimento possibilita a identificação e inserção de novos materiais de interesse, em programas de melhoramento, auxiliando no processo de domesticação das espécies (ZUANAZZI; MAYORGA, 2010).

Nesse sentido, este trabalho teve como objetivo realizar um levantamento dos artigos, teses e dissertações relacionados ao gênero Lippia, na área de conservação e domesticação, evidenciando a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) para a conservação desses RGVs.

Material e Método

Levantamento Bibliográfico

O levantamento bibliográfico abrangeu o período de 2002 a 2022. Os trabalhos acadêmicos utilizados para elaboração dessa pesquisa foram extraídos das bases de dados: Scientific Electronic Library Online (https://www.scielo.br/), Plataforma Periódicos CAPES (https://www-periodicos-capes-govbr.ezl.periodicos.capes.gov.br/), e ScienceDirect https://www.elsevier.com/pt-br/solutions/sciencedirect) e Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (https://bdtd.ibict.br/vufind/Content/whatIs). Utilizando-se os termos Lippia, Conservation, Cultivation, Domestication.

Seleção dos Trabalhos

Os trabalhos foram selecionados com base no título, resumo e palavras chaves, buscando identificar os trabalhos de acordo com a proposta da revisão bibliográfica. Adicionalmente, foi realizado o levantamento dos estudos já realizados na Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) com espécies do gênero Lippia, identificando artigos publicados, dissertações de mestrados e teses de doutorado nos sites dos Programas de Pós-Graduação da instituição. Dados de registro de coleta do herbário da instituição (HUEFS) também foram levantados, de acordo com o acesso aos dados de entrada no Herbário, através da plataforma speciesLink (https://specieslink.net/).

Sistematização dos Dados

Os dados foram organizados e sistematizados, através da confecção de gráficos e tabelas, utilizando Microsoft Excel e Microsoft Word.

Resultados e Discussão

Foram identificadas 74 publicações científicas sobre o gênero Lippia nas áreas de conservação e domesticação. Verificou-se que o maior número dessas publicações é na área de cultivo (54,7%) (Gráfico 1) e, refere-se, principalmente, à influência dos fatores ambientais no desenvolvimento vegetal e produção de óleos essenciais, visando formas de manejo que possibilitem maior produtividade desses compostos.

Os trabalhos de caracterização de germoplasma correspondem a 30,2% e incluem estudos voltados para avaliar a diversidade genética, a variabilidade fenotípica, e morfoagronômica das espécies. O desenvolvimento destes estudos possibilita a utilização dos recursos naturais de forma sustentável, assim como, contribuem para a inserção de materiais de interesse nos programas de pré-melhoramento e melhoramento genético das espécies (SOUZA, 2015)

Gráfico 1. Distribuição das publicações científicas por área de estudo, para as espécies do gênero Lippia, no período de 2002 a 2022.

Entre os representantes do gênero, Lippia alba (Mill.) N.E. Br. ex Britton & P. Wilson., L. sidoides Cham e L. origanoides Kunth. foram as espécies mais estudadas, com 21, 10 e 8 publicações, respectivamente (Gráfico 2). L. alba é uma espécie com ampla distribuição no Brasil, sendo uma espécie já domesticada e promissora para a exploração econômica. Popularmente conhecida como erva-cidreira, apresenta diversas finalidades e utilização e em campos diversos, como farmacêutico, perfumaria, agroindústria e cosmético (GIMENES et al., 2021). A espécie Lippia sidoides, conhecida como alecrim-pimenta, tem ampla ocorrência no Nordeste brasileiro, com propriedades antifúngicas e antimicrobianas comprovadas cientificamente (SOUZA, 2020).

Lippia origanoides Kunth, conhecida como alecrim-d’Angola,éutilizadapopularmentenotratamentodedesordens gastrointestinais e como antisséptico e cicatrizante de feridas e mucosas. L. origanoides ocorre em regiões áridas e semiáridas da América do Sul, sendo encontrada amplamente no Nordeste brasileiro (O’LEARY et al., 2012). Diferentes ações biológicas da espécie já foram comprovadas cientificamente, tais como: ação acaricida (MELO et al., 2020), inseticida (MAR et al., 2018), antioxidante (DAMASCENO et al., 2018), anti-cancerígena (RAMAN et al., 2018) e antibacteriana (BETANCOURT et al., 2019; LEAL et al., 2019; RIBEIRO et al., 2021). A espécie apresenta óleos essenciais com composição química variada, sendo conhecidos vários quimiotipos (STASHENKO et al., 2010; VEGAVELA et al., 2013; RIBEIRO et al., 2014).

As espécies do gênero Lippia, em sua maioria, são obtidas por meio do extrativismo, entretanto, essa prática, aliada à intensa fragmentação dos hábitats e elevado grau de endemismo das espécies tem contribuído para a perda da variabilidade existente e risco de extinção de espécies.

Gráfico 2. Número de publicações científicas por espécies do gênero Lippia, nas áreas de conservação e domesticação, no período de 2002 a 2022.

Fonte: Autores (2022)

A domesticação e conservação dessas espécies é uma prática que visa mitigar os danos causados pela ação antrópica, por conservar a variabilidade existente, bem como por gerar informações sobre os possíveis usos desse material conservado. Nesse sentido, a Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) vem desenvolvendo pesquisas na área de recursos genéticos de plantas medicinais desde 2003, apresentando maior impulso a partir de 2007, com a criação do Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV).

O levantamento no Herbário da instituição (HUEFS) identificou 1308 registros de coleta para o gênero Lippia, sendo Lippia origanoides Kunth. a espécie com maior número de registros (351), seguido de L. grata (118) e Lippia thymoides (104) (Gráfico 3).

Gráfico 3. Número de registros de coleta no Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) para o gênero Lippia Linn.

Fonte: Autores (2022)

Estudos sobre a biodiversidade de determinado local ou região podem ser realizados a partir do histórico biológico da localidade e dos dados armazenados em acervos, como herbários (DIAS et al., 2019). Pesquisas nas áreas de taxonomia, diversidade, conservação, ecogeografia e modelagem têm sido desenvolvidas com consultas a materiais herborizados, poupando tempo e recursos financeiros.

Muitas espécies do gênero Lippia encontram-se distribuídas naturalmente na região Nordeste, com ocorrência em domínios fitogeográficos como caatinga e cerrado (SALIMENA; MULGURA, 2015). Entretanto, algumas espécies apresentam-se em estado de vulnerabilidade, como é o caso de L. insignis, L. elliptica e L. bradei ou em perigo de extinção, como L. bromleyana, L. morii, e L. rhodocnemis

O elevado potencial econômico do gênero, aliado à acentuada perda da variabilidade das suas espécies, têm estimulado diversas pesquisas com o gênero Lippia na UEFS, já dispondo de um volume considerável de informações científicas sobre o gênero.

A base de dados da UEFS atualmente conta com 10 teses e 14 dissertações desenvolvidas com espécies pertencentes a este gênero, vinculadas aos Programas de Pós-graduação em Biotecnologia (PPGBiotec) e Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV). As pesquisas desenvolvidas foram, majoritariamente, relacionadas à atividade biológica, caracterização de germoplasma e cultivo dessas espécies (Tabela 1), sendo as espécies Lippia origanoides e L. insignis as mais estudadas.

Na área de cultivo e domesticação destacam-se os trabalhos desenvolvidos com as espécies Lippia bromleyana, Lippia lasiocalycina, Lippia insignis e Lippia thymoides, endêmicas do semiárido baiano (OLIVEIRA, 2014), onde se verificou a possibilidade de cultivo das espécies e identificou óxido de piperitona e limoneno; E-ocimenona, mircenona, mirceno, β-mirceno e ρ-cimeno; timol, mircenona e E-ocimenona; e β-cariofileno e germacreno D como sendo os compostos majoritários das espécies L. bromleyana, L. lasiocalycina L. insignis e L. thymoides, respectivamente.

Para a espécie Lippia origanoides destaca-se os estudos sobre propagação vegetativa e elicitação da espécie, onde foi demonstrado que a espécie pode ser propagada por estacas apicais com a utilização do AIB e a possibilidade do uso do ácido jasmônico para estimular maior produção de óleo essencial da espécie, identificando o carvacrol, γ-terpineno, ρcimeno, (E)-cariofileno, biciclogermacreno e timol como os componentes majoritários da espécie (SILVA, 2017). Destaca-se ainda o estudo ecogeográfico e caracterização agronômica, molecular e fitoquímica de acessos da espécie ocorrentes no Estado da Bahia, onde se verificou, entre diferentes acessos coletados nos estados da Bahia e Pernambuco, oito quimiotipos diferentes, evidenciando a variabilidade fitoquímica da espécie, bem como a existência de acessos mais promissores para o cultivo, devido à maior produção de óleo essencial. Verificou ainda altos índices de diversidade dentro das populações coletadas, indicando a região da Chapada Diamantina (Bahia) como área prioritária para coleta de germoplasma da espécie (FEIJÓ, 2018).

Para a espécie L. insignis destaca-se os estudos na área de cultivo, onde se verificou que a espécie pode ser cultivada em monocultivo, consórcio com palma forrageira e em sistemas agroflorestais, com elevado rendimento de óleo essencial por planta, variando entre 1,40 e 2,25% e influência da adubação na produção, teor e composição química do óleo essencial da espécie (SALES, 2020).

No período analisado, pesquisadores da UEFS publicaram vinte e um artigos em revistas especializadas, sendo Industrial Crops and Products e Journal of Ethnopharmacology as mais procuradas. Os estudos foram, majoritariamente, relacionados à atividade biológica e cultivo (Tabela 2), sendo L. thymoides e L. origanoides Kunth as espécies mais estudadas.

Os estudos relacionados à atividade biológica têm demonstrado a eficácia dos metabólitos das espécies de Lippia no combate a diversas doenças. Em estudos desenvolvidos com L. alnifolia, L. origanoides e L. insignis foi demonstrado atividade bacteriostática contra Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Salmonella choleraesuis e fungistática contra Candida albicans e Candida glabrata (TRINDADE et al., 2021), o que demonstra o grande potencial do gênero para geração de produtos e uso na indústria farmacêutica.

Tabela 1. Teses e dissertações com gênero Lippia na área de conservação e domesticação, publicadas pela UEFS no período de 2002 a 2022.

Título

Ano Tipo Program a

Atividade antimicrobiana e perfil químico de espécies do gênero Lippia do semi-árido da Bahia 2008 Dissertação PPGBiotec Potencial antimicrobiano e atividade antioxidante de espécies do gênero Lippia (Verbenaceae) do semi-árido baiano 2011 Dissertação PPGBiotec Biorreguladores vegetais, substratos e estaquia em Lippia origanoides KUNTH (Verbenaceae) 2012 Dissertação PPGRGV Estudo fitoquímico e farmacológico de Lippia thymoides Mart. & Schauer (Verbenaceae) 2012 Tese PPGBiotec Avaliação in vitro da atividade antimicrobiana e antiaderente de espécies do gênero Lippia do semi-árido da Bahia sobre micro-organismos presentes na placa bacteriana oral 2012 Dissertação PPGBiotec Efeito do complexo de inclusão contendo Beta-Ciclodextrina e óleo essencial de Lippia grata (Verbenaceae) na nocicepção orofacial em modelos experimentais 2013 Dissertação PPGBiotec Morfoanatomia, composição química e atividade biológica do óleo essencial de espécies nativas de Lippia 2014 Tese PPGRGV Investigação de atividade química e biológica de plantas do gênero Lippia 2015 Tese PPGBiotec Propagação, cultivo e produção de óleo essencial de espécies de Lippia (Verbenaceae) ocorrentes no Semiárido Baiano 2015 Dissertação PPGRGV Atividade inseticida de extratos e óleos essenciais de espécies do gênero Lippia contra Callosobruchus maculatus (Fabricius, 1775) e Nasutitermes corniger (Motschulsky, 1855) 2017 Dissertação PPGRGV Potencial antitumoral de espécies de Lippia (Verbenaceae) do estado da Bahia 2017 Dissertação PPGRGV Elicitores na produção, composição e ação biológica de metabólitos de Lippia origanoides Kunth. (VERBENACEAE)

Composição química e avaliação do potencial antinociceptivo do óleo essencial de Lippia bromelyana Moldenke (Verbenaceae) em camundongos

2017 Tese PPGRGV

2017 Dissertação PPGBiotec

Isolamento e identificação de substâncias com ação espasmolítica de folhas de Lippia thymoides Mart. & Schauer (Verbenaceae) 2018 Dissertação PPGBiotec Efeito anti-hiperalgésico do óleo essencial de Lippia grata livre e complexado em βciclodextrina em modelos animais de dor crônica não inflamatória e dor neuropática

2018 Tese PPGBiotec

Composição química e atividade biológica de Vanilla palmarum e Lippia alba 2018 Dissertação PPGBiotec Caracterização ecogeográfica, morfo-agronômica, molecular e fitoquímica de acessos de Lippia origanoides Kunth. ocorrentes no Estado da Bahia 2018 Tese PPGRGV Padronização do método de extração dos óleos essenciais de Lippia lasiocalycina Cham. e Lippia insignis Moldenke e suas nanoemulsões contra mosca das frutas 2019 Dissertação PPGRGV Bioatividade de óleos essenciais de espécies aromáticas no controle de Ceratitis capitata (Wied.) e Anastrepha fraterculus (Wied.) 2019 Tese PPGRGV

Potencial fotoprotetor e espasmolítico de Lippia origanoides 2019 Dissertação PPGBiotec Avaliação in vitro e in vivo do potencial biotecnológico de espécies de Lippia spp para o tratamento da candidíase bucal 2019 Tese PPGBiotec Ecogeografia e desempenho agronômico de Lippia insignis Moldenke em diferentes em diferentes sistemas de cultivo 2020 Dissertação PPGRGV Atividade biológica in vivo do óleo essencial de dois acessos de Lippia origanoides Kunth. (Verbenaceae)

Potencial Biotecnológico de Lippia alnifolia (VERBENACEAE): estudo químico e atividade biológica

2020 Tese PPGRGV

2020 Tese PPGBiotec Composição química e potencial farmacológico do óleo essencial de Lippia hermannioides

2021 Dissertação PPGRGV

Fonte: Autores (2022)

Tabela 2. Artigos publicados por pesquisadores da Universidade Estadual de Feira de Santana com espécies do gênero Lippia Linn., no período de 2002 a 2022.

Título Área de estudo Revista Referência Link

Geographical origin and drying methodology may affect the essential o

of Lippia alba (Mill) N.E. Brown

Antimicrobial Activity of Lippia Species from the Brazilian Semiarid Region Traditionally Used as Antiseptic and Anti-Infective Agents

Organic and mineral fertilization influence on biomass and essential oil production, composition and antioxidant activity of Lippia origanoides H.B.K.

Caracterização de Germoplasma

Atividade biológica

Cultivo

Lippia origanoides H.B.K. essential oil production, composition, and antioxidant activity under organic and mineral fertilization: Effect of harvest moment Cultivo

Pharmacological Basis for Traditional Use of the Lippia thymoides

Chemical composition and pharmacological properties of the essential oils obtained seasonally from Lippia thymoides.

Atividade biológica

Industrial crops and products

EvidenceBased Complementar y and Alternative Medicine

Industrial crops and products

Industrial crops and products

EvidenceBased Complementar y and Alternative Medicine

TELES et al. (2012)

PINTO et al. (2013)

https://doi.org/10 1016/j.indcrop.2 11.12.029

https://pubmed.n bi.nlm.nih.gov/2 109492/

TELES et al. (2014)

TELES et al. (2014)

https://doi.org/10 1016/j.indcrop.2 14.05.010

https://doi.org/10 1016/j.indcrop.2 14.06.008

SILVA et al. (2015)

Caracterização de Germoplasma Pharmaceutical Biology SILVA et al. (2015)

Propagação vegetativa e crescimento inicial de Lippia origanoides (alecrim-de-tabuleiro) Cultivo Horticultura Brasileira SILVA et al. (2015)

Effect of indolebutyric acid and cutting type on vegetative propagation of three Lippia species Cultivo Ciência Rural BISPO et al. (2016)

Agronomic and morphological characterization of Lippia (Verbenaceae species native from Brazilian semiarid region

Chemical Composition of Essential Oil of Leaves from Lippia schaueriana Mart. Collected in the Caatinga Area

Spasmolytic and antidiarrheal activities of Lippia thymoides (Verbenaceae) essential oil.

Relaxant effect of Lippia origanoides essential oil in guinea-pig trachea smooth muscle involves potassium channels and soluble guanylyl cyclase

Caracterização de Germoplasma

Brazilian Journal of Agriculture

https://oi.org/ 10.155/20154 63248

https://doi.org/10 3109/13880209. 015.100575

https://doi.org/10 159 0/S0102053620150 000200016

https://doi.org/10 1590/01038478cr20151029

OLIVEIRA et al. (2017)

Caracterização de Germoplasma Molecules SOUZA et al. (2018).

Atividade biológica

Atividade biológica

Natural Product Research

Journal of Ethnopharmac logy

MENEZES et al. (2018)

MENEZES et al. (2018)

https://www.rese rchg ate.net/profile/ Jose-FlorianoPastore/publicati n/3399 96231.pdf

https://doi.org/10 3390/molecules2 102480

https://www.tand online.com/doi/f l/10.1080/14786 19.2018.145766

https://doi.org/10 1016/j.jep.2018. 3.040

Continuação

Título

Leaf anatomy and essential oil production of Lippia native species

Lippia alnifolia essential oil induces relaxation on Guinea-pig trachea by multiple pathways

Central nervous system and analgesic profiles of Lippia genus

Influence of Lippia thymoides Mart. & Schauer and Lippia origanoides Kunth essential oils on planktonic cell and Streptococcus mutans biofilm growth.

Insecticidal activity of essential oils of species from the genus Lippia against Nasutitermes corniger (Motschulsky) (Isoptera: Termitidae)

Atividade antimicrobiana dos extratos metanólicos de diferentes espécies do gênero Lippia

Genetic diversity of Lippia origanoides Kunth. in natural populations using ISSR markers

Lippia origanoides essential oil induces tocolytic effect in virgin rat uterus and inhibits writhing in a dysmenorrhea mouse model

Área de estudo Revista Referência Link

Brazilian Journa of Agriculture OLIVEIRA et al. (2018)

http://www.revis tadegricultura.o g.br/index.php/re vistadeagricultu a/article/view/3 38

Atividade biológica

Atividade biológica

Journal of Ethnopharma cology VILELA et al. (2019)

Revista Brasileira de Farmacognos ia

Atividade biológica

Advancement in Medicinal Plant Research

LIMA et al. (2019)

OLIVEIRA et al. (2020)

Atividade biológica Sociobiology SANTOS et al. (2020)

Atividade biológica Research, Society and Development

https://doi.org/1 .1016/j.jep.2019 112162

https://doi.org/1 1016/j.bjp.2018 11.006

https://doi.org/ 10.30918/AMP .82. 20.019

DOI:10.13102 sociobiology.v6 i2.4992

TRINDADE et al. (2021)

Caracterização de Germoplasma Ciência e Agrotecnologia FEIJÓ et al. (2022)

Atividade biológica

Fonte: Autores (2022)

Journal of Ethnopharma cology MACÊDO et al. (2022)

http://dx.doi.org 10.33448/rsdv10i9.18051

https://doi.org/1 .1590/14137054202246000 22

https://doi.org/1 .1016/j.jep.2022 115099

As pesquisas desenvolvidas nessas áreas são de extrema importância para conservação da variabilidade genética das plantas do gênero Lippia, em sua maioria nativas silvestres, contribuindo para a domesticação e, consequentemente, inserção desses recursos genéticos em sistemas de produção sustentáveis, baseado em cultivo. Os avanços científicos nessas áreas poderão contribuir para a criação de uma cadeia produtiva a partir de espécies nativas, adaptadas às condições semiáridas, gerando matéria prima para indústria farmacêutica e de alimentos, gerando emprego e renda para as populações locais.

Conclusões

Devido ao elevado potencial econômico e riscos de perda do germoplasma existente, espécies vegetais pertencentes ao gênero Lippia têm sido estudadas em pesquisas científicas com vários enfoques, sendo que estudos voltados para a domesticação e conservação de germoplasma têm tido destaque. A Universidade Estadual de Feira de Santana tem contribuído na geração de informações sobre espécies nativas e silvestres de Lippia, pouco estudadas e com elevado risco de extinção, dada à intensa ocupação humana das áreas de ocorrência natural das espécies.

Referências

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Controle de qualidade e avaliação da atividade antimicrobiana in vitro de amostras comerciais do óleo essencial de Mentha piperita L. sobre E. coli

Diógenes da Luz Ferreira1, Jesana dos Reis Salomão2, Thamires Gonçalves Santos3, Ana Carolina Santana de Oliveira4 e José Luiz Carneiro da Rocha5

Resumo

A espécie Mentha piperita L.(hortelã-pimenta) apresenta propriedades anti-inflamatória, expectorante, antiespasmódica, vermífuga e antibacteriana. Escherichia coli é uma bactéria gram negativa natural do intestino e do trato urinário humano, podendo acarretar patologias como infecção urinária. A busca por terapias naturais ganha importância significativa por apresentar menor risco ao usuário do que terapias usuais. Este estudo objetivou avaliar a qualidade de três amostras comerciais do óleo essencial de M. piperita e, comprovar e comparar a ação bactericida e bacteriostática, por meio das técnicas de microdiluição (Concentração Inibitória Mínima - CIM) e de macrodiluição (Concentração Bactericida Mínima - CBM). Foi possível observar que tanto a CIM quanto a CBM para E. coli ATCC 25922 foi de 100 µL para dois dos três óleos essenciais. Testes de controle de qualidade como cor, odor, estado físico, densidade e índice de refração comprovou possível adulteração em um dos óleos essenciais, o mesmo que não apresentou resultados antibacterianos satisfatórios. Mais estudos são necessários para que as concentrações ideais da hortelã como antimicrobiano natural sejam determinadas.

Palavras-Chave: ação antibacteriana; microdiluição; macrodiluição; hortelã-pimenta; controle de qualidade

Abstract

(Quality control and evaluation of the in vitro antimicrobial activity of commercial samples of the essential oil of Mentha piperita L. on E. coli). The species Mentha piperita L. (peppermint) has anti-inflammatory, expectorant, antispasmodic, anthelmintic and antibacterial properties. Escherichia coli is a gram-negative bacteria naturally found in the human intestine and urinary tract, which can lead to pathologies such as urinary tract infection. The search for natural therapies gains significant importance because it presents less risk to the user than usual therapies. This study aimed to evaluate the quality of three commercial samples of the essential oil of M. piperita, and to prove and compare the bactericidal and bacteriostatic action, through the techniques of microdilution (Minimum Inhibitory Concentration - MIC) and macrodilution (Minimum Bactericidal Concentration - CBM). It was possible to observe that both MIC and MBC for E. coli ATCC 25922 was 100 µL for two of the three essential oils. Quality control tests such as color, odor, physical state, density and refractive index proved possible adulteration in one of the essential oils, which did not show satisfactory antibacterial results. More studies are needed so that the ideal concentrations of mint as a natural antimicrobial are determined.

Keywords: antibacterial action; microdiluition; macrodiluition; peppermint; quality control.

1 Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana (FAESF/UNEF), Avenida Luís Eduardo Magalhães, s/n, Subaé, CEP: 44001-544; Feira de Santana, BA, Brasil; email: diogenesluz@hotmail.com

2 Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana (FAESF/UNEF), Avenida Luís Eduardo Magalhães, s/n, Subaé, CEP: 44001-544; Feira de Santana, BA, Brasil; email: jesanasalomao@gmail.com

3 Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana (FAESF/UNEF), Avenida Luís Eduardo Magalhães, s/n, Subaé, CEP: 44001-544; Feira de Santana, BA, Brasil; email: thamiresbiom@gmail.com

4 Professor Doutor; Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana (FAESF/UNEF), Avenida Luís Eduardo Magalhães, s/n, Subaé, CEP: 44001-544; Feira de Santana, BA, Brasil; e-mail: anasantanoli@yahoo.com

5 Professor Doutor; Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana (FAESF/UNEF), Avenida Luís Eduardo Magalhães, s/n, Subaé, CEP: 44001-544; Feira de Santana, BA, Brasil; e-mail: luizcarneiro86@gmail.com

Introdução

A Mentha piperita L. é uma das plantas medicinais que mais apresentam propriedades farmacológicas, sendo popularmente conhecida como hortelã pimenta, pertencente à família Lamiaceae, é considerada uma herbácea originária da Europa. A planta é comumente usada para fins terapêuticos como anti-inflamatório, expectorante, antiespasmódico, vermífugo, sendo que estas ações possivelmente estão ligadas à presença de constituintes como monoterpenos, pulegona, 1,8-cineol, limoneno, neo-mentol, isomentona, carvona, acetato de metila, mentol e mentona (FIGUEIREDO et al., 2016; LOPES et al., 2017; SANTOS, 2011).

Plantas da família Lamiaceae, como as espécies M. spicata (hortelã miúdo), e Plectranthus amboinicus (hortelã graúdo) fazem parte da Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS) por apresentar inúmeras variedades terapêuticas, incluindo atividade antimicrobiana, que tem sido empregada na indústria farmacêutica. A partir dos óleos essenciais essas plantas têm tido uma ampla aplicação e apresentado alta eficácia na inibição de cepas de bactérias como a Escherichia coli interrompendo suas proliferações, estimando-se que as bactérias gram negativas apresentam maior sensibilidade em relação às gram positivas (VALERIANO et al., 2012; TRAJANO et al., 2009).

O aumento da resistência bacteriana aos fármacos torna os óleos essenciais de grande interesse, pois, pelo elevado número de pessoas acometidas por patologias de origem bacteriana, o tratamento com plantas medicinais torna-se uma opção de grande relevância (FIGUEIREDO, et al., 2016). Por essa razão, o trabalho dará maior embasamento à pesquisa e a busca de novas terapêuticas mais eficazes, menos agressivas e de menor custo, tanto para a população, quanto para seus desenvolvedores.

Os óleos essenciais são quimicamente caracterizados como misturas complexas de compostos de baixo peso molecular e, alguns deles, são altamente voláteis e capazes de gerar sabores e/ou aromas. Com isso os óleos essenciais podem apresentar problemas de qualidade que consequentemente acarretam a variabilidade de sua composição. Esses problemas abrangem desde condições ambientais desfavoráveis até a adulteração do óleo. Adição de compostos sintéticos e de óleos de menor valor são exemplos dessa adulteração, em que o rendimento do óleo é aumentado, através de misturas com agentes sintéticos comprometendo assim sua eficácia (PALA et al., 2010; PANDINI, 2018).

Possíveis adulterações na composição dos óleos essenciais podem ser identificadas através de suas características, que geralmente são solúveis em solventes orgânicos apolares, incolores ou amarelados, instáveis na presença de luz, ar, umidade, calor e possui índice de refração opticamente ativo. Isso serve de parâmetro para controle de qualidade dos óleos essenciais (SARTURI; BORCHAHARDT, 2017).

O objetivo deste estudo foi realizar análise de três marcas distintas de óleos comerciais de M. piperita para comparação, controle de qualidade e avaliação de sua ação antimicrobiana sobre E. coli por meio de métodos laboratoriais, descrevendo assim seus resultados para comprovação do seu efeito terapêutico.

Material e Métodos

Os óleos essenciais de M. piperita foram comprados em lojas especializadas da cidade de Feira de Santana - Bahia, onde a partir de informações dos fabricantes a extração desses óleos foi feita através de hidrodestilação por arraste a vapor. Os óleos foram enumerados de 1 a 3 para facilitar os procedimentos e as futuras análises.

Avaliação da atividade antimicrobiana

Os testes antimicrobianos, foram realizados com uma cepa padrão American Type Culture Collection (ATCC) de E. coli, cedida pelo Laboratório de Imunologia, Parasitologia e Microbiologia da Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana, BA. A amostra padrão utilizada foi a ATCC 25922.

A amostra bacteriana, obtida do estoque congelado a -20ºC, foi semeada em ágar Mueller Hinton (MH) e incubada em estufa bacteriológica (Nova Técnica 523) a 37ºC por 24 horas. Após o período de incubação, foi realizada coloração

de Gram para confirmar as características esperadas da amostra e elas foram transferidas para tubo de ensaio contendo 5 mL de caldo Mueller Hinton. O tubo foi incubado por 24 horas a 37ºC, obtendo-se a “cultura-mãe”.

Essa cultura teve sua turbidez ajustada usando espectrofotômetro (Global Trade 7220) e cubetas apropriadas. O comprimento de onda utilizado foi 660 nm e a absorbância foi ajustada de 0,08 a 0,1 Å, que corresponde a 1 a 3 x 10⁸ unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. A cultura ajustada foi chamada de inóculo.

Teste de ação antimicrobiana

Foram realizados métodos de macrodiluição e microdiluição em caldo utilizando os três diferentes óleos comerciais para a avaliação da atividade antimicrobiana do óleo essencial de M. piperita sobre as amostras de E. coli, tendo como base a “Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição para Bactérias de Crescimento Aeróbico” da ANVISA e padronizada pela National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003).

As diluições preparadas para o teste foram realizadas a partir da mistura do caldo Mueller Hinton e óleo essencial. A diluição seriada foi realizada em tubos Eppendorf com a concentração de 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,15 e 1,56 μL de óleo por 1 mL de meio de cultura.

Macrodiluição

No teste de macrodiluição, feito para estimar a concentração bactericida mínima, foram adicionados em microtubos 0,9 mL do meio de cultura acrescido da diluição seriada do óleo essencial (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,15 e 1,56 μL) e 0,1 mL do inóculo bacteriano da amostra padrão. Como controle positivo, foi utilizado o caldo e o inóculo bacteriano para ter certeza de que haveria atividade bacteriana no meio; como controle de esterilidade (controle negativo), apenas foi utilizado o meio de cultura.

Os testes foram realizados em triplicata. Os microtubos preparados anteriormente foram incubados a 37ºC por 24 horas e, após esse período, foram inspecionados visualmente para observar o crescimento bacteriano, confirmado pela turbidez. Após a análise visual, coletou-se 0,2 mL de cada tubo, que foram postos em placa de Petri e, com o auxílio de uma alça bacteriológica, o material foi espalhado em meio ágar Mueller Hinton. Essas placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Passado o período de incubação, as placas visuais, coletou-se 0,2 mL de cada tubo, que foram postos em placa de Petri e, com o auxílio de uma alça bacteriológica, o material foi espalhado em meio ágar Mueller Hinton. Essas placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas. Passado o período de incubação, as placas foram inspecionadas para observação do crescimento superficial de colônias bacterianas.

Microdiluição

A microdiluição foi feita para se descobrir a concentração inibitória mínima do óleo essencial para as amostras padrão de E. coli e, consequentemente, confirmar os resultados do procedimento anterior.

Após a preparação dos microtubos utilizados no experimento da macrodiluição, 180 μL de cada um deles foi coletado e transferidos para poços de placa de microtitulação. Foram adicionados à placa os controles positivos contendo o meio de cultura e o inóculo bacteriano e o controle negativo contendo apenas o meio de cultura para comprovar a esterilidade do mesmo. A placa foi incubada estaticamente a 37ºC por 24 horas.

Passado o período de incubação, o método colorimétrico com resazurina sódica 0,01% foi utilizado, aplicando-se 10 μL da solução em cada poço e esperando-se uma hora para realizar a leitura visual dos resultados, em que o azul caracteriza a inatividade bacteriana e o vermelho (ou rosa), a atividade.

Testes de controle de qualidade

As análises de controle de qualidade iniciaram-se através dos testes organolépticos de cor, odor e estado físico, onde em tubos de ensaio foram dispostas dez gotas de cada óleo essencial, e com o auxílio de um termômetro aferiu-se a temperatura e verificaram-se os parâmetros citados. Todos os protocolos seguiram os parâmetros descritos na Farmacopeia Brasileira (ANVISA, 2010).

Na sequência, para verificação da fração solúvel em água, em béqueres diferentes, foi colocado 30 mL de água destilada e três gotas dos óleos essenciais correspondentes. O teste foi realizado em triplicata.

A fim de mensurar a densidade dos óleos essenciais, com o auxílio de uma pipeta, 0,1 mL de cada amostra foi coletada e depositada em vidros de relógio, anteriormente tarados, e as amostras pesadas em balança de precisão (Marte AD2000). O teste foi realizado em triplicata e os valores foram convertidos em g/mL.

Quanto ao teste de resíduo de evaporação, papéis-filtro devidamente identificados foram pesados em balança analítica. Uma gota de cada óleo essencial foi depositada nos papéis e os mesmos foram adicionados à estufa de secagem (QUIMIS Q317M) pré-aquecida a 90°C, por uma hora. Após esse período, os papéis-filtro foram retirados da estufa e pesados novamente. O teste também foi realizado em triplicata para cada amostra.

Na determinação do índice de refração, utilizou-se um Refratômetro de bancada ABBE (Biobrix 2WAJ).

Resultados e Discussão

Avaliação da atividade antimicrobiana

No presente estudo, o primeiro teste aplicado para avaliação da atividade antimicrobiana do óleo foi o de macrodiluição, no qual, após a semeadura e incubação das placas de Petri foi observado o crescimento de colônias bacterianas nas quais a concentração do óleo essencial de M. piperita não foi suficiente para inibi-las (<100 µL). Nas placas em que foram utilizadas o óleo essencial 1 e 3, percebe-se que na concentração de 100 µL (maior concentração utilizada) ocorre inibição do crescimento bacteriano. Já nas placas em que foram utilizadas o óleo 2, não houve inibição em nenhuma das concentrações (Tabela 1).

Tabela 1. Resultados dos testes da atividade antimicrobiana do óleo essencial de Mentha piperita pela técnica de macrodiluição sobre amostra padrão de Escherichia coli (ATCC 25922).

Concentração (µL/mL)

Óleo 1 Óleo 2 Óleo 3 100 - +50 + + + 25 + + + 12,5 + + + 6,25 + + + 3,15 + + + 1,56 + + + C- - -C+ + + + +: presença de turvação do meio; -: ausência de turvação do meio; C-: Controle negativo; C+: Controle positivo.

Na segunda etapa do estudo foi aplicada a técnica de microdiluição para a amostra padrão de E. coli, onde 10 µL de resazurina sódica (7-hidroxi-3Hfenoxazina-3-ona-10-óxido) a 0,01% foram adicionadas a uma quantidade de cultura bacteriana com diferentes concentrações do óleo essencial em placa de microtitulação, como mostra a Figura 1. Notou-se que à medida que a concentração de óleo aumenta a coloração muda, sendo a cor azul indicativo de inibição da bactéria e rosa (ou vermelha) quando houve crescimento bacteriano.

Figura 1. Placa de microtitulação utilizada no teste de microdiluição com a adição da resazurina para a determinação da CIM da M. piperita sobre a cepa de E. coli (ATCC 25922). Legenda: A: óleo essencial 1; B: óleo essencial 2; C: óleo essencial 3; 1 a 7: concentrações do óleo essencial de 100 a 1,56 µL (respectivamente); C-: controle negativo; C+: controle positivo.

Pôde-se observar que a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração bactericida mínima (CBM) para a cepa padrão de E. coli foi de 100 µL em relação ao óleo 1 e 3. Já o óleo 2 não apresentou resultados satisfatórios em nenhuma das concentrações aplicadas. Comparando a outro estudo, de acordo com SILVA et al (2018), outras marcas de óleo essencial de M. piperita não tiveram resultados satisfatórios quanto a inibição da E. coli. Já, aplicando o óleo a cepas de Staphylococcus aureus, Acinetobacter e Candida albicans, dos seis fabricantes utilizados, um apresentou resultado positivo. A Tabela 2 mostra o resultado da microdiluição após a resazurina sódica ser adicionada aos poços.

Tabela 2. Resultados dos testes da atividade antimicrobiana do óleo essencial de Mentha piperita pela técnica de microdiluição e adição de resazurina sódica a 0,01% sobre amostra padrão de Escherichia coli (ATCC 25922). Concentração (µL/mL) Óleo 1 Óleo 2 Óleo 3 100

Legenda: A: azul – não há atividade microbiana; R: rosa – há atividade microbiana; C-: Controle negativo; C+: Controle positivo.

Através do teste de microdiluição, após a adição de resazurina sódica foi possível verificar que houve inibição do crescimento da Escherichia coli na maior concentração de alguns dos óleos essenciais configurando uma coloração azul à reação. Nos poços onde apresentaram a coloração rosa, entende-se que houve crescimento bacteriano, ou seja, a concentração do óleo essencial não foi suficiente para inibi-las.

A discrepância nos resultados para as três amostras utilizadas pode estar relacionada aos métodos adotados na produção dos óleos dos três fabricantes escolhidos, pois podem ocorrer alterações dos princípios ativos em relação ao período do ano em que a hortelã é colhida, qualidade do solo, processo de extração, composição do óleo etc., ou podem estar relacionados a qualidade da produção realizada.

Conforme PEGORARO et al (2010), a alta intensidade de luz e a adubação favoreceram o crescimento em biomassa, produzidos nos tricomas glandulares, influenciando no rendimento do óleo essencial, apresentando assim maior concentração do componente majoritário que é o mentol.

Em relação ao acondicionamento do óleo essencial comercial de M. piperita L, é preconizado estar hermeticamente fechado, ao abrigo da luz e do calor podendo utilizar frascos de vidro, metal ou polietileno o qual confere uma retenção de 50% de mentol, com uma pequena redução no percentual de óleo essencial. Considerando essas informações, o óleo essencial 2 mostrou-se fora dos padrões recomendados por ser comercializado em frasco transparente.

A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de M. piperita através dos testes em placas corroboram com o resultado do teste colorimétrico com resazurina sódica, onde revelam que o óleo 1 e 3 apresentam potencial inibidor na concentração de 100 µL, enquanto o óleo 2 demonstrou baixo potencial em todas as concentrações, o que possivelmente está ligado ao que foi citado anteriormente.

Logo, pode-se considerar que os óleos essenciais 1 e 3, em determinada concentração, apresentam maior potencial antimicrobiano que o óleo essencial 2, supostamente pelo fato de conterem substâncias que penetram mais facilmente pela camada lipídica, interferindo assim na ação do microrganismo (VALERIANO et al., 2012).

Testes de controle de qualidade

Visualmente, a qualidade dos óleos essenciais comerciais foi verificada e os resultados obtidos podem ser visualizados na Tabela 3. Os mesmos não apresentavam partículas estranhas em sua composição, e em relação à cor, estado físico e odor estavam dentro da normalidade. Exceto apenas pelo óleo essencial 2 que apresentava odor diferente dos demais, sendo considerado “rançoso” o que permitiu supor uma possível adulteração com óleo fixo à sua composição.

Tabela 3. Resultados dos testes organolépticos aplicados aos três óleos essenciais comerciais de Mentha piperita Parâmetros Dados teóricos* Óleo 1 Óleo 2 Óleo 3

Cor Incolor, amarelo pálido ou amarelo esverdeado pálido Incolor

Levemente amarelado Incolor

Odor Mentolado Característico Rançoso Característico

Estado Físico Líquido à 20°C Líquido Líquido Líquido *Fonte: Farmacopeia Brasileira, 2010.

O teste de fração solúvel em água preconiza a identificação imediata de alterações nos óleos essenciais mediante aparecimento de substâncias de coloração esbranquiçadas das amostras em contato com a água. Não houve adulterações por substâncias polares nas amostras, entretanto, o óleo essencial 2 teve desempenho diferenciado das outras amostras, apresentando adesão as paredes do béquer com aspecto levemente gorduroso não característico de óleo essencial.

Os valores do teste de densidade foram obtidos através de média e desvio padrão. Percebeu-se que os valores dos óleos comercializados 1 e 2 encontraram-se com pouca discrepância em relação aos dados presentes na Farmacopeia Brasileira, já o óleo essencial 3 apresentou densidade dentro do proposto, como mostra a tabela 4.

Tabela 4. Média e desvio padrão da densidade para Mentha piperita à 21°C. Densidade teórica (g/mL)* Óleo 1 (g/mL) Óleo 2 (g/mL) Óleo 3 (g/mL) 0,900-0,916 0,836±0,011 0,820±0,020 0,906±0,011

*Fonte: ANVISA, 2010.

O teste de resíduo de evaporação é utilizado como parâmetro para avaliar adulterações dos óleos essenciais adicionados por óleo fixo, já que são usados ilegalmente para aumentar o rendimento dos mesmos. Foi observado que as amostras do óleo essencial 1 e 2 apresentaram resíduos, após a última pesagem, de 0,001g a mais para o óleo 1 e de 0,005g, respectivamente. Já o óleo essencial 3 não apresentou resíduo após o teste, se mostrando dentro da normalidade.

Para o teste de índice de refração, foram realizadas as leituras, em duplicata, e os valores das 3 amostras apresentaram-se em consonância com o estabelecido pela Farmacopeia Brasileira (2010), como consta na Tabela 5.

Tabela 5. Valores do índice de refração para Mentha piperita

Dado teórico* Óleo 1 Óleo 2 Óleo 3

1,457 a 1,467 a 20°C 1,459 1,458 1,457

*Fonte: ANVISA, 2010.

Conclusão

As plantas medicinais contribuem com a ampliação da eficácia terapêutica, e, a partir dos constituintes presentes em seus óleos essenciais, torna-se de grande importância para a indústria farmacêutica. O óleo essencial da M. piperita apresenta resultados positivos quanto à inibição da E. coli, o que interrompe sua proliferação.

Diante disso, resultados como os obtidos no presente trabalho para o óleo essencial 2, são de extrema importância visto que desde os testes laboratoriais o produto apresentou baixa eficácia quanto à inibição de E. coli, o que a partir dos testes de controle de qualidade como o de odor e resíduos de evaporação, pôde-se estabelecer uma relação e concluir uma possível falsificação do óleo.

O presente estudo demonstrou a relação da qualidade e do potencial antimicrobiano dos óleos essenciais comerciais comprovando, através de análises in vitro como o CIM e CBM, que ele inibe o crescimento bacteriano à medida que sua concentração é aumentada e que a qualidade de produção é preservada. Com isso o estudo também apresenta relevância por possibilitar pesquisas futuras relacionadas à hortelã, aplicando a outros tipos de bactérias e variedade maior de óleo essenciais comercializados, podendo, com seus resultados, aprimorar a terapia antibacteriana correlacionando ou não à terapia já existente.

Agradecimentos

Unidade de Ensino Superior de Feira de Santana (UNEF).

Referências

ANVISA. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. Farmacopeia Brasileira. Volume 1 e 2. 5 ed. Brasília, 2010.

FIGUEIREDO, C. H. A. et al. A utilização medicinal da Mentha spp. Informativo técnico do semiárido. v. 10, n. 2, p. 16-20, Paraíba, 2016.

NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS – NCCLS. Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição para Bactéria de Crescimento Aeróbico: Norma Aprovada. 6. ed. Norma M7-A6 do NCCLS, v.22, n.2, p.14-19, 2003.

PALA, A. C. T.; SALIN, C. T.; CORTEZ, L. E. R. Controle de qualidade de óleos essenciais de Alecrim (Rosmarinum officinalis) e Lavanda (Lavandula augustifolia) comercializados em farmácias de dispensação. Disponível em: http://www.cesumar.br/prppge/pesquisa/mostras/quin_mostra/amanda_caroline_to me_pala.pdf. Acesso em 21 dez. 2019.

PEGORARO, R. L. et al. Produção de óleos essenciais em plantas de Mentha x piperita L. var. piperita (Lamiaceae) submetidas a diferentes níveis de luz e nutrição do substrato. Rev. Brasileira de Botânica. v. 33, n. 4, p. 631-637. São Paulo, 2010.

SANTOS, C. O. Óleo essencial de Mentha piperita L.: uma breve revisão de literatura. 2011. 20f.Trabalho de Conclusão de Curso - Universidade estadual da Paraíba. Paraíba, 2011.

SARTURI, C. S.; BORCHHARDT, M. D. Avaliação de identidade, pureza e metais em óleos essenciais de Melaleuca alternifolia Cheel (Melaleuca), Mentha x piperita L. (Hortelã Pimenta) e Rosmarinus officinalis L. (Alecrim). Luminária, União da Vitória, v.19, n.02, p. 30 – 38. 2017.

SILVA, A. J. et al. Avaliação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais obtidos de diferentes fabricantes. Sinapse Múltipla. v. 7, n. 2, p. 131-134. Minas Gerais, 2018.

SILVEIRA, J. C. et al. Levantamento e análise de métodos de extração de óleos essenciais. Enciclopédia Biosfera, Centro Científico Conhecer, v. 8, n. 15; p. 201. Goiânia, 2012.

TRAJANO, V. N. Propriedade antibacteriana de óleos essenciais de especiarias sobre bactérias contaminantes de alimentos. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 29, n. 3, p. 542-545. Campinas, 2009.

VALERIANO, C. et al. Atividade antimicrobiana de óleos essenciais em bactérias patogênicas de origem alimentar. Rev. Bras. Pl. Med., v. 14, n. 1, p. 57-67. Botucatu, 2012.

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Correlação entre composição química de folhas de Zanthoxylum caribaeum Lam (Rutaceae) e atividade antioxidante

Carine Raisa Barbosa de Andrade1, Lara Amanda Rodrigues2, Danielle Figuerêdo da Silva3; Clayton Alves Queiroz4 e Hugo Neves Brandão5

Resumo

Zanthoxylum caribaeum Lam é utilizada na medicina tradicional por suas propriedades anti-inflamatórias, apesar da falta de estudos sobre sua eficácia. O objetivo do trabalho foi avaliar a composição química e atividade antioxidante dessa espécie. Para caracterização química, os extratos das folhas de Z. caribaeum foram submetidos a triagem fitoquímica, sendo identificados alcalóides, taninos, cumarinas, flavonoides, esteroides/terpenos; e CLAE-DAD, identificando ácido trans ferulico, rutina, ácido gálico e ácido cafeico. Fenóis e flavonoides totais foram obtidos pelos métodos de Folin Ciocalteau e cloreto de alumínio, respectivamente. O conteúdo fenólico variou entre os extratos de 16,18 ± 0,04 a 45,06 ± 0,04 g AGE/100 g, e o de flavonoides variou entre 0,34 ± 0 a 0,99 ± 0,03 g QE/100g de extrato. A atividade antioxidante foi avaliada pelos métodos de sequestro do radical livre DPPH e β-caroteno/ácido linoleico. O extrato acetato de etila foi o mais ativo, apresentando CE50 de 1,12 mg/mL e 75,9%, respectivamente. Os resultados obtidos mostram que esta espécie pode ser uma promissora fonte de compostos fenólicos antioxidantes.

Palavras-Chave: cromatografia; radicais livres; plantas medicinais; metabólitos secundários.

Abstract

(Correlation between chemical composition of leaves of Zanthoxylum caribaeum Lam. (Rutaceae) and antioxidant activity). Zanthoxylum caribaeum Lam is used in traditional medicine for its anti-inflammatory properties, despite the lack of studies on its effectiveness. The objective of this work was to evaluate the chemical composition and antioxidant activity of this species. For chemical characterization, extracts from the leaves of Z. caribaeum were submitted to phytochemical screening, identifying alkaloids, tannins, coumarins, flavonoids, steroids/terpenes; and HPLC-DAD, identifying trans ferulic acid, rutin, gallic acid, and caffeic acid. Total phenols and flavonoids were obtained by the Folin Ciocalteau and aluminum chloride methods, respectively. The phenolic content varies between the extracts from 16,18 ± 0.04 to 45.06 ± 0.04 g EGA/100 g and that of flavonoids varied between 0.34 ± 0 to 0.99 ± 0.03 g EQ/100 g of extract. An antioxidant was obtained by free radical scavenging DPPH and β-carotene/linoleic acid methods. The ethyl acetate extract was the most active, presenting EC50 of 1.12mg/mL and 75.9%, respectively.The results show that this species can be a source of antioxidant phenolic compounds.

Keywords: chromatography; free radicals; medicinal plants; secondary metabolites.

Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: raica_ba@hotmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: lara.amanda@live.com

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: dfsilva@uefs.br

4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cleiroz@gmail.com

5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.br

Introdução

Espécies vegetais pertencentes à família Rutaceae se destacam por apresentarem importância econômica, ecológica e medicinal, podendo ser relatados os frutos comestíveis do gênero Citrus (limão, laranja, tangerina), a madeira (Flindersia, Zanthoxylum, Balfourodendron, Euxylophora), os óleos aromáticos (Boronia e Ruta) e os medicamentos, a exemplo dos “jaborandis” do gênero Pilocarpus que produzem substâncias ativas de grande interesse como o alcaloide pilocarpina, que são empregados no tratamento de glaucoma (PIRANI, 1999; SANTOS et al. 2009).

Espécies do gênero Zanthoxylum (Rutaceae), apresentam uma variedade de metabólitos secundários que podem ser encontrados nas raízes, caule, ramos e folhas. Dentre os compostos isolados e identificados na literatura destacam-se os alcaloides, lignanas, ligninas, flavonoides, taninos, cumarinas, esteróides, triterpenos, glicosídeos, saponinas e óleos essenciais, dos quais apresentam várias propriedades terapêuticas que podem estar relacionados ao uso popular como medicinais (NURAIN et al., 2017; TINE et al., 2017; ZHANG et al., 2016; TAVARES et al., 2014).

Tais compostos apresentam muitos efeitos farmacológicos de grande importância, despertando interesse de pesquisadores na investigação química-biológica desta família. Entre as ações biológicas relatadas com espécies deste gênero estão as atividades antifúngica, antibacteriana, inseticida, anti-helmíntica, atividade antitumoral, analgésica, antiinflamatórias e atividade antioxidante (BUNALEMA et al., 2017; CHOI, 2016; PEREIRA et al., 2010; SU et al., 2017; ZUO et al., 2016; WEBER, 2005; COSTA et al., 2010).

A espécie Zanthoxylum caribaeum Lam., encontra-se distribuída nas Antilhas, Barbados, Costa Rica, Guadalupe, Martinica, Panamá, Porto Rico e Nordeste da América do Sul, além da Argentina e Paraguai. Esta espécie é de ocorrência em todo o Brasil, conhecida popularmente como espinho-cheiroso, espinheiro-preto e espinho-de-barrão (MELO; ZICKEL 2004). Apesar do uso medicinal de Zanthoxylum caribaeum com propriedades antiinflamatória pela população (VILLALBA et al., 2007) salienta-se que existem poucos estudos com essa espécie. Destaca-se no entanto, estudos realizados com essa espécie apresentando propriedades antimicrobiana dos extratos e óleos essenciais (SOUZA et al., 2017; ORDAZ PICHARDO et al., 2014), acaricida (NOGUEIRA et al., 2014a) e inseticida (NOGUEIRA et al., 2014b).

Muitas evidências têm indicado que a presença de radicais livres e outros agentes oxidantes são responsáveis pelo desenvolvimento de diversas enfermidades, tais como; doenças inflamatórias, doenças degenerativas associadas ao envelhecimento incluindo as cardiovasculares e doenças neurodegenerativas, como as de Parkinson e Alzheimer (SOUZA et al,. 2007; ADEWUSI; STEENKAMP, 2011; MOO-HUCHIN et al., 2013).

Os antioxidantes são substâncias que em baixas concentrações inibem ou retardam significativamente os processos oxidativos das moléculas ao impedirem a iniciação ou propagação da reação de oxidação em cadeia, além de prevenirem ou reparar danos ocasionados às células e tecidos pelos radicais livres (SCOTTI et al., 2007; SOUSA et al., 2007).

Alguns antioxidantes de origem sintética são frequentemente utilizados pela indústria alimentícia, de medicamentos e cosméticos. Porém, diversas pesquisas têm evidenciado a possibilidade de estes antioxidantes acumularem no organismo e manifestarem alguns efeitos tóxicos. No entanto, esses efeitos não são observados em antioxidantes de origem natural, extraídos a partir de espécies vegetais e alguns tipos de alimentos que possuem elevada atividade antioxidante (HAIDA, et al., 2007; DENG et al., 2011; ADEWUSI; STEENKAMP, 2011).

Muitos extratos de plantas têm apresentado significativa atividade antioxidante, capaz de minimizar os efeitos nocivos gerados pelos radicais livres. Desta forma, muitos estudos vêm sendo realizados para caracterização das propriedades antioxidantes de diversas plantas, e identificação dos constituintes responsáveis por estas atividades (NASCIMENTO et al., 2010).

Neste sentido, para contribuir com o conhecimento sobre as propriedades químicas e biológicas desta espécie, os objetivos deste trabalho foram verificar o perfil fitoquímico através de cromatografia a líquidos de alta eficiência com detector de arranjo de diodos (CLAE-DAD) e testes colorimétricos e de precipitação, bem como, determinação do teor de fenólicos e flavonoides totais, e avaliação do potencial antioxidante dos extratos de Zanthoxylum caribaeum Lam.

Material e Métodos

Coleta e identificação

A coleta da espécie em estudo foi realizada no município de Cruz das Almas Bahia, localizada entre as coordenadas 12 42’ 20.3’’ S e 39 06’ 24.1’’ W. A exsicata foi depositada sob registro HUEFS 178575 e identificada pelo especialista na família Dr. Milton Groppo Junior.

Preparo dos extratos

As folhas de Z. caribaeum Lam. foram secas, pulverizadas e submetidas a técnica de extração por maceração utilizando metanol como solvente extrator. A solução foi concentrada em rota evaporador sob pressão reduzida, originando o extrato bruto metanólico (EBZC) (159,44g) com rendimento de 5,79%. O EBZC foi submetido a processo de partição líquido-líquido com solventes orgânicos de polaridades crescentes, como hexano, clorofórmio e acetato de etila. Os solventes foram evaporados para a obtenção dos extratos hexânico (EHZC): 25,13g (16,31%); clorofórmico (ECZC): 17,08g (11,09%) e acetato de etila (EAZC): 6,48g (4,21%).

Triagem Fitoquímica e Análise do perfil cromatográfico por CLAE-DAD

Os extratos EBZC, EHZC ECZC, EAZC foram submetidos a triagem fitoquímica prévia para determinação das principais classes de metabólitos secundários (MATTOS, 1997). Foram realizados testes para a identificação de compostos fenólicos e taninos [cloreto férrico 2% (FeCl3), acetato de cobre a 3%, acetato de chumbo a 10%], flavonoides (Reação de Shinoda), antraquinonas (Reação de Borntraeger), alcaloides (Reativo de Mayer e reativo de Draggendorff.), esteróides/ triterpenos (Reação de Lieberman-Burchard), cumarinas (KOH 10%), cardiotônicos (reativo de Kedde) e saponinas (solução aquosa).

As amostras foram submetidas à técnica de CLAE-DAD para traçar o perfil cromatográfico dos extratos da espécie (fingerprint). Foram identificados compostos fenólicos comparando-o com padrões comerciais tais como: rutina, ácido trans ferúlico, ácido cafeico e ácido gálico.

O método utilizado foi adaptado de Cíchová e colaboradores (2008), em que os extratos foram analisados em cromatógrafo Varian e detector de arranjo de diodo Varian ProStar. A separação cromatográfica foi realizada por meio de coluna LiChroCART PurospherStaR® 100 8-e (250 mm x 4,6 mm i.d.) (5μm) (Merck, Darmastad, Germany) combinado com pré-coluna apropriada da Merck. Os extratos foram diluídos com a fase móvel orgânica (acetonitrila-MeCN: ácido acético 0,7% (8:2)) e filtrados em cartucho de extração em fase sólida (SPE-C18). O melhor gradiente de eluição obtido foi a solução de ácido acético 0,7% (Fase A) e acetonitrila (MeCN): ácido acético 0,7% (8:2) (Fase B) descrito na Tabela 1. As condições cromatográficas incluíram: fluxo de 1 mL/min, volume de injeção de 20µL, faixa de comprimento de onda de 220-600 nm. Os cromatogramas foram comparados em diferentes comprimentos de onda, quanto ao número de picos e a qualidade dos mesmos. Os extratos foram submetidos a CLAE-DAD para análise qualitativa das substâncias. Os espectros na região do foram adquiridos em escala de 200 – 500 nm que permitem a análise da presença de compostos fenólicos com auxílio do detector de arranjo de diodo e a aquisição cromatográfica foi definida em 280 nm. A identificação dos compostos fenólicos foi conduzida pela comparação dos tempos de retenção e dos espectros de ultra-violeta com os padrões de referência, além de dados de literatura.

Tabela 1. Gradiente de eluição

Tempo (min) Fase A Fase B 0:00 95 5 1:00 95 5 5:00 90 10 12:00 83 17 30:00 20 80

Fonte: autores

Determinação de fenólicos e flavonoides totais

A determinação do teor de fenóis totais presentes nos extratos EBZC; EHZC; ECZC; EAZC, foi realizado por meio de espectroscopia na região do visível a 760nm utilizando o método colorimétrico de Folin Ciocalteau (FC) com modificações (GEORGÉ et al, 2005). Foi utilizado padrão de ácido gálico para a construção da curva analítica e os resultados foram expressos em mg de ácido gálico equivalente (AGE)/ 100 gramas de extrato.

A quantificação de flavonoides totais nos extratos foi realizada por método espectrofotométrico de acordo com Pothitirat e colaboradores (2009), utilizando o cloreto de alumínio (AlCl3). A aquisição da absorbância foi realizada em espectrofotômetro Multiskan GO 3.2 a 415 nm, e a partir dos resultados foi construída a curva de calibração com o padrão quercetina, cuja equação foi utilizada para o cálculo dos teores de flavonoides totais. O conteúdo de flavonoides foi expresso em gramas de quercetina equivalentes (QE)/ 100g do extrato.

Atividade antioxidante

A atividade antioxidante dos extratos EBZC; EHZC; ECZC; EAZC foi avaliada por meio de duas metodologias diferentes, baseadas na redução de radicais livres 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) pela transferência de elétrons descrita por MALTERUD et al. (1993) e teste de inibição da co-oxidação do β-caroteno descrito por MARCO (1968) e posteriormente modificado por MILLER (1971).

Para o teste com DPPH foi preparado uma solução metanólica de DPPH a 45μg/mL e tomada uma alíquota de 3 mL adicionando-se a esta, 50 μL da amostra. O propilgalato foi utilizado como controle positivo. As amostras foram preparadas em cinco diferentes concentrações variando entre 0,25 a 30 µg/mL. Após 15 minutos de reação foram realizadas as leituras das absorbâncias em espectrofotômetro UV/VIS em 517 nm (Mensor et al. 2001). As atividades sequestrantes de DPPH foram expressas em porcentagem a partir da seguinte fórmula: % sequestro = 100 (A0 – At) / (A0p – Ap), em que: A0 = absorbância inicial da solução de DPPH; At = absorbância final da amostra após reação com DPPH; A0p = absorbância inicial do padrão; Ap = absorbância final do padrão.

Ométododeoxidaçãodoβ-caroteno/ ácido linoléico avalia a atividade de inibição de radicais livres gerados durante a peroxidação do ácido linoleico. A reação foi monitorada por espectrofotômetro pela perda da coloração do β-caroteno em 470 nm, com leitura imediata e em intervalos de 10 min, por um período total de 2 h. Foi utilizado o propilgalato como padrão e etanol como branco. A capacidade antioxidante foi expressa por percentual de inibição através do decaimento da absorbância, medido em relação ao controle a partir da seguinte fórmula: AA = 100 [1- (A0 - At) / (A00 - At0)].

Todos dados foram submetidos à análise de variância unidirecional (ANOVA) utilizando o teste de Tukey com diferença significativa (P <0,05), as análises estatísticas foram realizadas com Bioestat e Microsoft Excel 2007. Todas as leituras foram realizadas em triplicata. A regressão linear foi utilizada para calcular a CE50 (concentração efetiva para se obter o sequestro de 50% dos radicais DPPH).

Resultados

Triagem Fitoquímica e Análise do perfil cromatográfico por CLAE-DAD

A análise das reações de caracterização fitoquímica dos extratos EBZC, EHZC, ECZC e EAZC ocorreu pela mudança de coloração, formação de precipitados e espuma persistente, sugerindo a presença de diferentes grupos de metabólitos secundários como fenóis, taninos, flavonoides, cumarinas, alcaloides e esteroides/triterpenos, assim como, a ausência de antraquinonas, saponinas podendo ser observado na Tabela 2.

Tabela 2. Triagem fitoquímica no extrato bruto e frações de Zanthoxylum caribaeum Lam.

CLASSES QUÍMICA REAGENTES EB EH EC EA

Alcaloides

Draggendorff Mayer + +-

Taninos Cloreto Férrico Acetato de chumbo Acetato de cobre

+ + +

--

+ + + +

+ + +

+ + +

Saponinas Índice de espuma - - -Cumarinas KOH + + + +

Flavonoides Reação Shinoda + + + + Esteróides/ Triterpenos Liberman-Buchard + + + +

Antraquinonas Borntraeger - - -Heterosídeos cardiotônicos Reativo de Kedde - - -Presença/ausência das classes de metabólitos secundários: (-) reação negativa; (+) reação Positiva

A aquisição dos cromatogramas foi realizada em diferentes comprimentos de onda entre 220-600 nm para obtenção do melhor comprimento e análise do perfil cromatográfico de cada extrato, levando em consideração a resolução e o número de picos avaliados. Através das análises dos cromatogramas os extratos EBZC, ECZC e EAZC apresentaram melhor resolução em 280 nm, entretanto o EHZC apresentou melhor resolução no comprimento de onda em 250 nm. Os cromatogramas nos diferentes comprimentos de onda podem ser observados na Figura 1.

a b )

250nm 280nm 300nm 320nm 350nm

EBZC 250nm 280nm 300nm 320nm 350nm

ECZC 250nm 280nm 300nm 320nm 350nm

EHZC 250nm 280nm 300nm 320nm

220nm c d

EAZC

Figura 1. Comparação dos cromatogramas em diferentes comprimentos de onda a) Extrato bruto Z caribaeum (EBZC), b) Extrato clorofórmico (ECZC), c) Extrato hexano (EHZC) e Extrato acetato de etila (EAZC). Fonte: autores

Foi possível verificar nas análises dos cromatogramas que há variação no perfil de todos os extratos, observando a presença de variedades de compostos fenólicos, destacando os ácidos fenolicos e derivados flavônicos a partir da análise dos espectros de absorção característicos no UV (220-290 nm e λmax= 330 aprox.) e (λmax 240-285 e λmax 300-400 nm), respectivamente (SANTI et al. 2014; ZUANAZZI; MONTANHA 2010). A análise por CLAE-DAD do EAZC

possibilitou a identificação de compostos fenólicos por meio da comparação dos tempos de retenção (TR) e dos espectros de absorbância dos picos obtidos da amostra com os dos padrões. Foram identificadas ácido transferulico, rutina, e ácido cafeico (Figura 2).

1 a 2 b

Figura 2. Cromatograma 280 nm e espectro no UV-Vis da EAZC analisados por CLAE-DAD. 1a- Substância ácido trans ferulico. 2b- Substância ácido cafeico e rutina. Fonte: autores

Determinação de fenólicos e flavonoides totais

O conteúdo de fenólicos totais obtido pelo método de Folin Ciocalteau, expressos em g de AGE/100g de extrato e o teor de flavonoides totais, obtidos a partir dos valores expressos em g de QE/100g de extrato podem ser observados na Tabela 3.

Tabela 3. Comparativo entre a atividade antioxidante (DPPH e β-caroteno) e teor de fenóis totais e flavonoides de Zanthoxylum caribaeu

Amostras Fenóis totais (AGE em mg/g de extrato) Flavonoides (EQ em mg/g de extrato)

DPPH (CE50 mg/ml) sistema β-caroteno (%AA)

EBZC 31,99 ± 0,03 b 0,34 ± 0,02 a 4,74 ± 0,15 c 51,40 ± 0,18 a EHZC 16,18 ± 0,04 a ND 15,34 ± 0,03 eECZC 45,06 ± 0,04 d ND 9,08 ± 0,06 d 53,68 ± 0,02 a EAZC 35,08 ± 0,03 c 0,99 ± 0,03 b 1,12 ± 0,16 b 75,91 ± 0,53 b

Propilgalato ND ND 0,21 ± 0,24 a 87,31 ± 0,3 b

ND = não determinado. EBZC = extrato bruto metanolico, EHZC, extrato hexânico e EAZC extrato acetato de etila de zanthoxylum caribaeum. Os valores referem-se à média das triplicatas ± desvio padrão. Médias na mesma coluna seguidas de letras iguais não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey (p < 0,05). Fonte: autores

Atividade antioxidante

A avaliação da atividade oxidante pelo sequestro DPPH permitiu obter os valores de CE50 para cada extrato analisado. Os resultados podem ser consultados na tabela 3. No método da inibição da auto-oxidação do β-caroteno, os resultados das amostras avaliadas foram expressos como percentual de inibição da oxidação. O extrato hexânico não foi possível determinar o percentual de inibição da oxidação. Nesse teste, os resultados foram comparados com propilgalato, que apresentou 87,3% de atividade antioxidante. Na análise estatística observou-se que EAZC não apresentou diferença significativa diante do padrão propilgalato (Tabela 3).

Discussão

Pode-se observar neste estudo que os extratos de Z caribaeum apresentaram variedade de metabólitos secundários. A presença destes compostos nos extratos pode contribuir para o efeito biológico da espécie, inclusive atividade antioxidante.

Em estudo realizado por SOUZA et al., (2020) com extratos da mesma espécie foram detectados compostos semelhantes ao deste estudo, determinando a presença de esteroides, flavonoides, flavonas, flavonoides, taninos, triterpenoides, xantonas e saponinas

Assim como, em diversos estudos realizados com espécies do gênero Zanthoxylum foram isolados e identificados uma variedade de compostos químicos nos extratos das raízes, caules e folhas; como fenóis, flavonoides, cumarinas, taninos, cumarinas, lignanas, ligninas, alcaloides, esteroides e triterpenos (MOCELLINE et al., 200; ZANON, 2010; GONZAGA et al., 2003; WEBER, 2005; FACUNDO et al., 2005).

A reação negativa para as antraquinonas, saponinas e cardiotônicos são indicativos da ausência ou baixo teor desses metabólitos nos extratos avaliados. Apesar de não serem detectados estes compostos nos extratos desta espécie neste estudo, foram relatados a presença de quinonas, saponinas, cardiotônicos, carotenóides, antocianinas, no extrato etanolico da espécie coletados em diferentes regiões do Norte de Santander, situado na Colombia, bem como foram identificados compostos semelhantes a este estudo como os alcaloides, taninos, flavonoides, cumarinas e triterpenoides realizados por CHAVES-BEDOYA et al. (2022). A presença de quinonas, saponinas e cardiotônicos também foram detectados em estudos realizados em espécies do gênero (AKHTAR et al., 2009; PAULINE et al., 2013).

Entretanto, vale ressaltar que variações no perfil dos metabólitos secundários podem estar relacionadas a diversos fatores, como desenvolvimento, sazonalidade, índice pluviométrico, temperatura, altitude, presença de nutrientes, incidência da luz solar, ataques de patógenos, bem como o farmacógeno e técnicas de extração utilizadas, dentre outros (GOBBO NETO; LOPEZ, 2007).

A identificação dos compostos como rutina, ácido caféico, ácido trans ferúlico por CLAE –DAD nos extratos de Zanthoxylum caribaeum, corroboram aos de triagem fitoquímica preliminar, determinando a presença de uma variedade de compostos fenólicos, mesmo não sendo possível evidenciar todas as classes de metabólitos indicados nos testes de prospecção fitoquímica. Isto ocorre, devido às limitações do método utilizado, sendo que a utilização de detectores de DAD permite apenas a detecção de compostos que apresentem grupos cromóforos, muito utilizado na determinação de compostos fenólicos.

Em estudos realizados com a espécie Zanthoxylum bungeanum, foram identificados xantiletina, sesamina, quercetrina, quercetina, rutina, kaempferol-3-ramnosídeo, ácido clorogênico e hiperosideo (ZHANG et al., 2014), demonstrando a variedade de compostos fenólicos presentes em extratos de folhas de espécies do gênero Zanthoxylum, dos quais apresentam alta atividade antioxidante conhecido em literatura.

Apesar do extrato clorofórmico em seguida o extrato acetato de etila apresentarem os maiores conteúdos de fenólicos totais, o extrato acetato de etila exibiu maior atividade antioxidante, tanto utilizando os radicais DPPH, como através do sistema β-caroteno o que demonstra a espécie Zanthoxylum caribaeum uma fonte potencial de substâncias com atividade antioxidante (Tabela 3).

Em estudos realizados por SOUZA et al. (2020), confirma o potencial antioxidante da espécie, no qual demonstra que o extrato etanolico das folhas de Zanthoxylum caribaeum apresenta ser um bom sequestrador de radicais livres, com valor de IC50 (24,39 μg mL -1), bem como, os extratos solúveis em acetona (AcO), metanol (MeOH) e acetato de etila (AcOEt) apresentando percentual moderado de atividade antioxidante quando comparado ao antioxidante comercial BHT, com atividade antioxidante de 92,80% e valor de IC50 = 7,93 μg mL-1

Outras pesquisas descrevem a atividade antioxidante de espécies do gênero, como a Zanthoxylum alatum (CE50 = 0,067 mg/mL), Zanthoxylum ailanthoides (CE50 = 0,84 mg/mL), Zanthoxylum piperitum (CE50 = 7,41 µg/mL), que apresentou nos extratos, frações e substâncias isoladas das folhas destas espécies, capacidade sequestradora de radicais livres (CHO et al., 2003; YANG, 2011; GULERIA et al., 2013).

No entanto, neste estudo não foi determinado o conteúdo de flavonoides nos extratos clorofórmico e hexânico (Tabela 3) podendo estar relacionado a ausência destes compostos ou também a presença de flavonoides sem hidroxilas, o que demonstra a limitação do método de flavonoides totais, por ser baseado na complexação dos íons alumínio, que ocorre em locais específicos como na presença de hidroxilas.

O teor de fenólicos totais teve resultados superiores aos encontrados com outras espécies da família. O extrato bruto de Z. syncarpum Tull. apresentou 166,74 mg de ácido gálico/g de extrato, demonstrando baixo teor de fenóis comparando com os obtidos para o EBZC (319,9 mg de ácido gálico/g de extrato) (SILVA, et al., 2014), assim como, estudos realizados com as espécies Zanthoxylum rhetsa DC (6,01 ± 0,04 mg/g) (TUKUN et al., 2014), Z. planispinum (391 mg ácido gálico/g de extrato bruto) (HWANG; PAK, 2009). Zanthoxylum alatum (Extrato clorofórmico 0.74 mg/g, acetato de etila 4.36, extrato metanólico 1.64 mg/g e Extrato éter de petróleo 5.12 mg/g) (MUKHIJA; KALIA, 2014) apresentaram baixo teor de fenóis totais.

Além disso, muitos metabólitos secundários, em especial os compostos fenólicos, com propriedades antioxidantes estão relacionados a outras propriedades biológicas, por exemplo, cardioprotetoras, antimutagênicas, antimicrobiana, citotoxidade em células tumorais in vivo, bem como, exercem efeitos farmacológicos em distúrbios neurológicos (ADEWUSI; STEENKAMP, 2011. AHMED et al., 2013; BOULANOUAR et al., 2013).

Os resultados deste estudo corroboram com dados obtidos por outros autores, os quais relacionam o teor de substâncias fenólicas e o potencial antioxidante de extratos vegetais. Isto indica que os conteúdos fenólicos e flavonoides nos extratos podem ser responsáveis pelo potencial antioxidante de Zanthoxylum caribaeum. Além disto, a espécie apresentou uma variedade de metabólitos secundários, demonstrando ser promissora para outros estudos químicos e biológicos que assegurem o uso terapêutico popular.

Conclusão

A análise fitoquímica permitiu identificar a presença de diferentes classes de metabólitos secundários nos extratos das folhas de Zanthoxylum caribaeum, como alcaloides, taninos, cumarinas, flavonoides, esteroides/terpenos, evidenciando o potencial químico e farmacológico da referida espécie.

Além disso, foi possível identificar por CLAE-DAD, ácido trans ferúlico, rutina e ácido cafeico. A presença dessas substâncias corrobora com os resultados de fenólicos, flavonoides totais e da atividade antioxidante, que foi mais evidenciada para o extrato acetato de etila.

Os resultados obtidos demonstram a necessidade da continuidade do trabalho através de técnicas cromatográficas e espectroscópicas, para isolar e identificar as substâncias responsáveis pela ação antioxidante da espécie.

Este estudo contribui para o conhecimento da composição química da espécie Zanthoxylum caribaeum, e consequentemente com a quimiotaxonomia do gênero Zanthoxylum e da família Rutaceae.

Agradecimentos

À CAPES e FAPESB pela bolsa concedida, e a Dr Milton Groppo Júnior pela identificação da espécie.

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1

Estudo das linhas de pesquisa e caracterização agronômica de Physalis angulata L.

Maryelle Vanilla de Abreu Cerqueira1, Adriana Queiroz de Almeida2, Marilza Neves do Nascimento3 e Maria Clara de Figuerêdo Galiano4

Resumo

Physalis angulata é uma Solanaceae de grande importância econômica, possuindo ampla distribuição no Brasil, país que possui os principais polos de produção de pesquisa científica relacionadas à espécie. Esse trabalho teve como objetivo a realização de levantamento bibliográfico dos aspectos gerais relacionados à cultura do camapú, abordando o seu potencial produtivo e econômico, linhas de estudos e formas de cultivo. As pesquisas foram baseadas em teses, dissertações, resumos, manuais técnicos, sítios eletrônicos e, principalmente, artigos científicos. Além disso, foi realizada uma bibliometria por meio da Plataforma Scopus. A partir dos dados obtidos observou-se que Physalis angulata recebe atenção nacional, com destaque científico para o Instituto Oswaldo Cruz e para o Horto Florestal da UEFS, os quais realizam pesquisas relacionadas, principalmente, ao seu potencial fitoterápico, associado a compostos secundários. Do ponto de vista agronômico, observou-se que o cultivo da espécie é considerado simples, onde a principal forma de propagação é a sexuada. Os frutos são caracterizados como bagas globosas protegidos pelo cálice inflado. Além disso, estudos revelaram que essa espécie apresenta tolerância a ambientes em condições de estresse hídrico, mas necessita de investimentos na nutrição do ambiente de cultivo para que a planta expresse boa produtividade.

Palavras-Chave: Camapú; pesquisa científica; produção; bibliometria; fitoterapia.

Abstract

(Study of the research lines and agronomic characterization of Physalis angulata L.) Physalis angulata is a Solanaceae of great economic importance, with wide distribution in Brazil, a country that has the main centers of scientific research production related to the species. This study aimed to carry out a bibliographic survey of the general aspects related to the culture of camapú, addressing its productive and economic potential, lines of study and forms of cultivation. The research was based on theses, dissertations, abstracts, technical manuals, websites and, mainly, scientific articles. In addition, a bibliometric was performed using the Scopus Platform. From the data obtained, it was observed that Physalis angulata receives national attention, with scientific emphasis on the Oswaldo Cruz Institute and the UEFS Forest Garden, which carry out research related mainly to its phytotherapeutic potential, associated with secondary compounds. From the agronomic point of view, it was observed that the cultivation of the species is considered simple, where the main form of propagation is sexed. The fruits are characterized as globose berries protected by the inflated chalice. In addition, studies have shown that this species has tolerance to environments under conditions of water stress, but requires investments in the nutrition of the cultivation environment so that the plant expresses good productivity.

Keywords: Camapú; scientific research; production; bibliometrics; phytotherapy.

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina S/N, Feira de Santana –BA, Brasil. E-mail: maryellevanilla@gmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina S/N, Feira de Santana –BA, Brasil. E-mail: aqalmeida@uefs.com.br

Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina S/N, Feira de Santana –BA, Brasil. E-mail: mnnascimento@uefs.br

4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina S/N, Feira de Santana –BA, Brasil. E-mail: mclarafigueredog@gmail.com

Introdução

Solanaceae A. L. Jussieu é uma das famílias economicamente mais importantes entre os Angiospermas, possuindo cerca de 92 gêneros e 2.300 espécies (HUNZIKER, 2001) amplamente distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (SOARES et al., 2003). Nesse sentido, a América do Sul destaca-se como centro de diversidade dessa família, onde existem 34 gêneros aceitos (FLORA DO BRASIL, 2020).

Entre os diversos gêneros de Solanaceae, Physalis destaca-se por apresentar potencialidades comerciais relacionadas à culinária e farmacologia, onde os frutos são consumidos in natura na composição de saladas, uma vez que a sua acidez adocicada é apreciada por grandes chefes, que também a utilizam para a decoração de pratos refinados (TANAN, 2015). Além disso, existem muitos trabalhos associando alguns compostos presentes nas plantas com a ação medicinal, como flavonoides, alcaloides e fitoesteroides, especialmente as fisalinas (TOMASSINI, et al., 2000). Nesse sentido, Physalis angulata L recebe destaque nacional, além de ser uma planta nativa da América do Sul (MOSCHETTO, 2005).

Popularmente conhecida como camapú ou balão-rajado (STEHMANN; KNAPP, 2020), P. angulata é uma planta herbácea, de fácil cultivo, com técnicas de manejo realizadas de modo semelhante à cultura do tomate, devido à falta de recomendações agronômicas para a espécie (RUFATO et al., 2008), também sendo considerada como planta espontânea em diversas regiões. Além disso, é uma espécie multiuso e, dessa forma, constitui-se em uma excelente alternativa para o mercado nacional e internacional, uma vez que os seus frutos possuem elevado conteúdo nutracêutico (VELASQUEZ et al., 2007).

A partir do presente estudo observou-se que, de maneira geral, dentre as unidades de desenvolvimento de pesquisas relacionadas à espécie, a Fundação Oswaldo Cruz destaca-se a nível mundial. Em seguida, a Unidade Experimental Horto Florestal (UNEHF) da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), onde há a segunda maior produção de pesquisas com P. angulata desenvolvidas pela comunidade acadêmica e colaboradores, representando um grande aporte ao desenvolvimento de pesquisas para o conhecimento da espécie. a Unidade Experimental Horto Florestal (UNEHF) da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), onde há a segunda maior produção de pesquisas com P. angulata desenvolvidas pela comunidade acadêmica e colaboradores, representando um grande aporte ao desenvolvimento de pesquisas para o conhecimento da espécie.

Apesar das potencialidades fitoterápicas reconhecidas em P. angulata, e do investimento financeiro de muitas empresas e instituições de ensino na prospecção de novos fármacos naturais, ainda são necessárias pesquisas objetivando a difusão de conhecimento e tecnologias para o desenvolvimento da espécie, de forma sistemática, englobando aspectos que vão desde o cultivo até exploração de seus recursos. Desta forma, torna-se necessário o investimento em estudos que visem esclarecer tais aspectos produtivos, de forma a contribuir para o desenvolvimento de saberes técnico-científicos sobre a cultura.

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi realizar um estudo e levantamento bibliográfico dos aspectos gerais relacionados à cultura da Physalis angulata, abordando as suas potencialidades, especificações e linhas de pesquisa.

Material e Métodos

Foi realizada uma pesquisa teórica - bibliográfica, tomando como base teses, dissertações, resumos, manuais técnicos da Embrapa e, principalmente, artigos científicos, totalizando 65 documentos.

Foram realizadas buscas em sítios eletrônicos diversos: Google Acadêmico, Portal de Periódicos da Capes e do RGV UEFS, Scielo, Elsevier (Scopus), Flora do Brasil 2020 e Discovery Life, no período compreendido entre janeiro a setembro de 2021. As palavras-chave utilizadas foram “Physalis angulata” e “Produção de camapú”.

Foi utilizado o software livre QGIS versão 3.16.8 ‘Hannover’ para a tabulação de dados e produção de mapas, além do VOSviewer para análise bibliométrica.

Inicialmente, a revisão de literatura foi realizada com base no método de Bibliometria, proposto por ARAÚJO (2006), que consiste no uso de técnicas estatísticas para caracterizar informações literárias, representando uma análise quantitativa e qualitativa de dados científicos e tecnológicos. O levantamento de dados foi realizado na Plataforma Scopus, que é considerada uma das principais bases de dados, com reconhecimento internacional. As demais informações encontradas sobre a espécie, foram selecionadas e organizadas conforme os pontos descritos.

A revisão bibliográfica apresenta a análise dos seguintes pontos: a bibliometria como ferramenta para a análise do perfil e caracterização das pesquisas já realizadas com Physalis angulata; descrição botânica da espécie; aspectos agronômicos e potencial fitoterápico.

Para buscas na Plataforma Scopus, as palavras-chave utilizadas no levantamento bibliométrico foram: “Physalis angulata”. Foram apresentados 366 resultados de busca, majoritariamente individualizadas, havendo pouca relação entre instituições ou países.

Resultados e Discussão

Bibliometria

Os primeiros registros de trabalhos relacionados à P. angulata foram no ano de 1948. As principais áreas de estudo apresentadas sobre a espécie são: agricultura e biologia, potencial farmacológico, bioquímica, desde engenharias, veterinária, ciências sociais e da computação. Esse resultado evidencia a grande diversidade de interesses sobre a espécie. Quanto ao volume de produção por afiliações (Figura 1), a instituição com destaque de publicações é a Fundação Oswaldo Cruz, seguida da Unidade Experimental Horto Florestal da UEFS, contribuindo para que o Brasil seja o país de maior produção científica relacionada à Physalis angulata, com 106 documentos registrados. Isso pode ser explicado pelo fato de a espécie ser nativa da América do Sul (MOSCHETTO, 2005), o que impulsiona o interesse nacional. A China é o segundo território com maior volume de publicações registradas (40), seguido da Indonésia e Estados Unidos (34 ambos).

Documentos por instituição

Universidade Estadual de Feira de… Fundação Oswaldo Cruz

United States Department of Agriculture

Ministry of Education China

Universidade de São Paulo

Shenyang Pharmaceutical University

Universidade Federal do Pará

China Pharmaceutical University

Universidade Federal do Recôncavo…

Universidade Federal do Rio de Janeiro

05 101520 25 30

Figura 1. Publicações sobre Physalis angulata registrados por afiliações. Fonte: Adaptado de Scopus, 2021.

Produção institucional

Como apresentado anteriormente, a instituição com maior número de publicações sobre P. angulata é a Fundação Oswaldo Cruz, com estudos direcionados, principalmente, para o potencial medicinal da espécie. O segundo maior polo desenvolvedor de pesquisas, científicas do mundo, relacionadas à P. angulata, é a Unidade Experimental Horto Florestal (UNEHF), localizada em Feira de Santana – BA (Figura 2).

Figura 2. Localização da UNEHF (Unidade Experimental Horto Florestal). Fonte: IBGE, 2019.

A UNEHF consiste em um centro de Ensino, Pesquisa e Extensão universitária vinculado ao Departamento de Ciências Biológicas da UEFS, realizando atividades nas áreas de Fisiologia Vegetal, Educação Ambiental, Botânica Econômica e Preservação de Recursos Genéticos Vegetais, com atenção a culturas presentes no Semiárido Nordestino. No Horto Florestal da UEFS já foram realizadas várias pesquisas científicas sobre a espécie aqui relatada (Tabela 1), que vão desde o seu cultivo até o potencial medicinal (destaque de inúmeras pesquisas publicadas em revistas internacionais). Os estudos verificados nessa unidade experimental são realizados pela comunidade acadêmica, mais especificamente um grupo de pesquisa que envolve estudantes de graduação, pós-graduação, docentes e colaboradores.

Tabela 1. Trabalhos realizados com Physalis angulata no Horto Florestal (UNEHF). Área temática

Aspectos agronômicos e climáticos

Propagação

Estresse ambiental

Estudo genético

Aspectos medicinais

Referências

Abreu et al., 2017; Barroso, 2019; Carvalho et al., 2011; Chaves, 2017; Cruz et al., 2015; Fonseca et al., 2018; Leite et al., 2017; Leite et al., 2018; Tanan et al. 2015; Tanan et al., 2018; Tanan et al., 2019, Silva et al., 2018.

Barroso, 2019; Neto et al., 2019; Oliveira et al., 2013; Pereira, 2011; Souza, 2009; Souza et al., 2011; Souza et al., 2014; Souza et al., 2017; Ramos, 2019.

Cruz et al., 2017; Fonseca et al., 2015; Leite et al., 2018; Leite et al., 2019; Leite et al., 2021; Marques, 2012; Silva et al., 2017; Silva et al., 2021; Souza et al., 2007; Souza et al., 2011.

Araújo et al., 2015; Chaves 2017; Marques, 2012; Silva, 2018.

Abreu et al., 2017; Pereira, 2011; Tanan et al., 2019.

Outros* Tanan et al., 2017 *Protocolos de extração e quantificação de pigmentos fotossintéticos.

Fonte: autores

Aspectos botânicos

A Physalis angulata, popularmente conhecida como camapú, balão-rajado, balãozinho ou joá-de-capote, é uma espécie pertencente à família Solanaceae e nativa da América do Sul (STEHMANN; KNAPP, 2020). É uma planta de porte herbáceo, atingindo até 70 cm de altura (TANAN, 2015). Possui caule ereto, anguloso, glabro ou com tricomas esparsos. As folhas apresentam-se de forma alternada e suas lâminas são ovaladas-lanceoladas e assimétricas, com margem inteira ou dentada (RUFATO et al., 2008). As flores são pequenas e simples, com lobos triangulares, sépalas lanceoladas e corola de tonalidade esverdeada/amarela (Figura 4) (STEHMANN; KNAPP, 2020).

Estudos realizados em condições de campo por CHAVES et al. (2017) constataram que a abertura dos botões florais de P. angulata inicia-se por volta de 6 da manhã, estando todos abertos às 8 horas e fecham-se em torno das 17 horas, evidenciando, desta forma, o fechamento noturno - provavelmente como mecanismo de defesa para a proteção dos elementos reprodutivos (Figura 3).

Um órgão de grande destaque no camapú são os seus frutos, que consistem em bagas globosas envolvidas pelo cálice inflado, assemelhando-se a um balão (Figura 3), que possui finalidade de proteção às adversidades ambientais e herbivoria. Os frutos são caracterizados como climatéricos, endocarpo e mesocarpo carnosos, são comestíveis e com sabor doce e insípido, de coloração amarela a esverdeada quando maduros (OLIVEIRA, 2018).

As sementes de P. angulata são numerosas e pequenas, sendo necessária a ajuda de um microscópio para visualização das suas estruturas. Cada fruto apresenta uma média de 197 sementes (SOUZA et al., 2017), e, de acordo SOUZA et al. (2010), o seu peso médio é de 0, 025 g (50 sementes), com teor de água em torno de 7%, onde a turgidez é alcançada após uma hora em contato com o líquido.

O caule de P. angulata apresenta o tecido do colênquima constituído por duas camadas de células angulares, e o córtex possui três camadas celulares. Já na raiz, o seu córtex possui 3 a 4 camadas de células e a medula é contemplada por parênquima (FERREIRA, 2018).

Aspectos agronômicos

A maior parte dos frutos de Physalis encontrados nos supermercados brasileiros advém da Colômbia, visto que a produção comercial no Brasil ainda não recebe muita atenção (CRUZ et al., 2014). Os frutos de P. angulata são utilizados na culinária e, principalmente, na medicina popular, devido à sua diversidade de ação fitoterápica. Camapú é uma planta de grande valor nutricional e econômico, estando enquadrada na categoria das pequenas frutas (RUFATO et al., 2013).

Geralmente, a P. angulata cresce espontaneamente em solos agriculturáveis, onde são consideradas como plantas daninhas, podendo ser nocivas a diversas culturas, tais como arroz, algodão e soja (OZASLAN et al., 2016). Isso aponta que a espécie não apresenta grandes exigências para ser cultivada de forma esporádica. Mesmo mostrando-se uma cultura de fácil adaptação, as informações sobre a produção e manejo ainda são consideradas escassas, o que pode ser visto como um fator limitante ao seu cultivo (OLIVEIRA, 2018). Muitas das recomendações são baseadas na produção de Physalis peruviana, espécie de maior importância comercial do gênero.

FISCHER (2000) afirma que temperaturas muito altas podem prejudicar a floração e frutificação do gênero Physalis. Para P. angulata, os melhores índices produtivos ocorrem entre 23 a 26°C, durante os meses de abril a junho, para a região do Recôncavo Baiano (ABREU et al., 2017). Estudos comparativos entre espécies de Physalis em Feira de Santana-BA, realizados em campo por TANAN (2015), constataram que P. angulata apresentou-se como a mais tolerante às condições edafoclimáticas da região, mas não tolerando temperaturas maiores que 30ºC.

Segundo FISCHER (2000), o regime de chuvas ideal para o gênero é entre 1.000 a 2.000 mm bem distribuídos durante o ano, e umidade relativa do ar entre 70 a 80%. O autor salienta que o abastecimento irregular de umidade pode levar a rachaduras nos frutos. Além disso, ABREU et al. (2017) demonstraram em seus estudos que o período de melhor resposta produtiva do camapú foi entre abril a junho, para a região do Recôncavo Baiano, com precipitações entre 70 a 150 mm.

Para as condições edafoclimáticas do Semiárido baiano, TANAN (2015) e LEITE (2019) observaram que a produtividade de P. angulata pode alcançar 5 t ha-1 e 167 frutos por planta, com peso máximo de 2,5 g quando maduros, atingindo estágio de maturação entre o terceiro e o quarto mês após semeadura (em campo). De acordo com LEITE et al. (2017), o ciclo de cultivo pode ser em torno de 80 a 94 dias, com possibilidade de colheita aos 40 dias, após transplante em meio hidropônico. Quanto à propagação de Physalis, FISCHER (2000) defende que a forma mais simples e mais utilizada é por meio de sementes. As flores são polinizadas facilmente pelo vento ou por insetos, onde os polinizadores mais comuns são as abelhas Apis mellifera (CHAVES et al., 2017).

De acordo com CARVALHO et al. (2014), cálices em estágio de maturação de coloração verde e teor de umidade próximo a 10% apresentam as melhores condições de germinação (90%), uma vez que a maturidade fisiológica das sementes de camapú normalmente ocorre com o início da mudança de coloração dos frutos, tornando-se fisiologicamente viáveis a partir de 21 dias após antese (21 DAA), mas com maior potencial fisiológico aos 35 DAA (SANTIAGO et al., 2016). Além disso, as sementes de camapú podem ser armazenadas em sacos de papel (embalagem porosa) ou recipiente de vidro (CARVALHO et al., 2014).

Para a semeadura, FISCHER (2000) afirma que o distanciamento é enquadrado nas medidas de 2 a 3 m entre plantas e 2 a 3 m entre linhas, porém, estudos realizados por LISSNER e VELA (2009) apresentaram avanços para o conhecimento da cultura de P. angulata, os quais recomendam um espaçamento ideal de 2,00 x 1,00 m para cultivos de base agroecológica. Para cultivo não-agroecológico, SILVA (2018) utilizou 1,0 m x 0,8 m.

Apesar de popular, um problema apresentado pela semeadura direta é a desuniformidade, devido a fatores relacionados com a maturação e armazenamento dos frutos (FISCHER, 2000). Nesse contexto, a Physalis também pode ser reproduzida assexuadamente, por estacas, cultivos in vitro e enxertia (MUNIZ, 2011).

Para a condução, manejo e estabelecimento da produtividade da cultura, além das práticas convencionais como capina, as podas são recomendadas (CAMPOS DE MELO et al., 2017). FISCHER (2000) ressalta a importância do tutoramento para que haja maior desempenho e facilidade de manutenção.

A nutrição do solo é outro fator importante para o desenvolvimento das culturas. Estudos realizados por FONSECA (2018), apontam que a maior disponibilidade de N, P e K no solo auxiliaram para o crescimento de plantas de P. angulata, obtendo maiores alturas médias (49,15 cm) e diâmetro (10,49 mm). De acordo com LEITE et al. (2018a), a fertilização com Nitrogênio é capaz de induzir a concentração de compostos específicos relacionados aos grupos funcionais presentes nas raízes, caules e folhas de Physalis.

O Fósforo também é um nutriente de grande importância para o desenvolvimento das plantas. A adubação fosfatada pode proporcionar um acréscimo no número de folhas e na área foliar de P. angulata, enquanto a deficiência desse nutriente reduz a massa seca da planta e impede a floração e frutificação do camapú (CRUZ et al., 2015). Apesar do Potássio (K) ser um elemento imprescindível nos processos metabólicos que envolvem a fotossíntese, a respiração e a síntese proteica, não foram encontradas pesquisas que discorrem sobre a importância do uso isolado de K, bem como de micronutrientes, em plantas de P. angulata.

A adubação orgânica também é uma opção muito relevante para a produção vegetal, além de atender um grande nicho de mercado. Segundo OLIVEIRA (2018), o uso combinado de NPK e estercos de ave curtidos em camapú proporcionam plantas maiores e mais produtivas, com frutos mais vistosos. Além disso, o esterco bovino curtido com NPK pode contribuir em médias em concentração de micronutrientes nas folhas.

Em relação à colheita, TANAN (2015) salienta que os frutos da espécie devem ser retirados quando indicarem o último estágio de maturação, pois apresentam maior quantidade de açúcares. Em estudos realizados pela autora foi possível concluir que os teores de sacarose podem dobrar a cada nível de maturação do camapú, podendo atingir até 162,4 mg g-1 por fruto. Ainda segundo a autora, várias outras alterações ocorrem durante esse período, como produção de compostos voláteis, transformações bioquímicas, alteração na textura e taxa respiratória. Nesse sentido, a coloração do fruto e do cálice são fundamentais para o reconhecimento visual do ponto de colheita.

Outro fator importante a ser considerado em qualquer cultivo é a incidência de pragas e doenças. No Brasil, ainda há poucos estudos relacionados à fitossanidade do camapú, mas, de maneira geral, as principais pragas que acometem as plantas de Physalis pertencem às ordens Hemíptera e Lepdóptera (MOSCHETTO, 2005). Em estudos realizados por PEIXOTO et al. (2010), utilizando diferentes fontes de adubação orgânica no camapú, em Ipameri - Goiás, foi constatada uma elevada incidência de ácaro branco na cultura, provocando perdas de botões florais. LISSNER et al. (2009) relata a presença de lagarta (Heliothis subflexa) em cultivo de base agroecológica na Região Central do Rio Grande do Sul, causando danos à integridade física dos frutos.

No tocante às doenças que acometem as plantas do gênero, as de ocorrência mais comum na Colômbia, país com maior produção mundial, são: Cercospora sp., Phoma sp. (Requeima), Alternaria sp., Botrytis sp. e Xanthomonas sp. (RUFATO et al., 2013).

Informações sobre produção e manejo de P. angulata em condições brasileiras ainda são consideradas escassas, especialmente em regiões com características semiáridas, o que pode ser encarado como um entrave à expansão e investimentos dessa espécie no setor agrícola (LEITE, 2019), uma vez que muitos fatores ainda precisam ser estudados para melhorar a qualidade e produtividade das plantas (TANAN, 2019).

Potencial medicinal

P. angulata é alvo de muitos estudos químicos e farmacológicos (TANAN, 2019), onde tem sido sugerido que ela é imunomoduladora eficaz e citotóxica para diversos tipos de células cancerígenas, além de possuir propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias (CABRAL, 2005; FERREIRA, 2018). Nesse sentido, para vias de estudo, compostos químicos como os vitaesteróides - substâncias bioativas, caracterizadas como lactonas esteroidais (TOMASSINI et al., 2000). O camapú apresenta em sua composição uma variedade de compostos fitoquímicos, tais como: terpenoides, taninos, saponinas e cumarinas (FERREIRA, 2018).

A folha do camapú se destaca como órgão que concentra maior quantidade e diversidade de metabólitos secundários (esteróides, terpenoides e taninos). Seus frutos também possuem concentrações relevantes de flavonoides, alcaloides e fitoesteróides, além de serem ricos em vitaminas A e C, fósforo e ferro (FERREIRA, 2018). Os esteróides são os compostos bioquímicos de maior distribuição e órgãos como raiz, caule e folhas apresentaram diversas fisalinas isoladas em extratos, que podem ser detectadas pelo método de espectroscopia infravermelha, devido às diferentes funções oxigenadas presentes no grupo (LEITE et al., 2018a). Segundo TOMASSINI et al. (2000), o principal grupo de esteróides

encontrado em P. angulata são as fisalinas, que recebem a nomenclatura de lactonas sesquiterpênicas esteroidais, destacadas pela complexidade da estrutura molecular, pois além da lactona, apresentam uma g lactona fundida ao anel D.

As fisalinas podem ser utilizadas na prevenção de diversas doenças, tais como a malária, asma, hepatite, dermatite e reumatismo (ADAMS et al., 2009). De acordo com SHARMA et al. (2015), os alcalóides e fisalinas presentes na P. angulata são importantes produtos químicos responsáveis pelos vários medicamentos, mostram-se eficientes para atividades antitumorais (ISMAIL; ALAM, 2001), anti-leishmania (GUIMARÃES et al.,2010), imunomoduladora (SOARES et al., 2003) e anti-inflamatórias (CHECON, 2011). Os compostos medicinais presentes em P. angulata podem ser extraídos e utilizados por meio extratos das partes aéreas ou infusão das raízes (SOARES et al., 2003; COELHOFERREIRA, 2009).

Conclusão

O Brasil apresenta o maior polo de pesquisas de Physalis angulata, com destaque à Instituição Oswaldo Cruz e o Horto Florestal da UEFS, o que configura o potencial nacional de contribuição para o desenvolvimento da espécie estudada, especialmente no tocante à produção.

O camapú possui algumas especificidades para o manejo dos sistemas de cultivo comerciais, apesar de se mostrar tolerante ao estresse ambiental devido à eficiência no uso de água. Sobre o potencial econômico, há destaque para a exploração medicinal, devido à concentração de metabólitos secundários, o que estimula investimentos em pesquisas relacionadas.

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Germinação in vitro de espécies de cactáceas nativas da Bahia com potencial ornamental

Resumo

O estabelecimento in vitro através da germinação de sementes possibilita a manutenção da variabilidade genética bem como a redução nas taxas de contaminação durante o início das culturas em ambiente asséptico e controlado. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar o efeito do meio de cultura e carvão ativado na germinação in vitro de Discocactus zehntneri, Stephanicereus luetzelburgii e Pilosocereus gounellei. Para tanto, sementes coletadas em Morro do Chapéu e Mucugê, Chapada Diamantina – BA foram armazenadas e inoculadas em ágar e nos meios MS (MURASHIGUE e SKOOG, 1962) e MS com metade da concentração salina (MS/2) suplementados com 30 e 15g L-1 de sacarose respectivamente, na ausência ou presença (2 g L-1) de carvão ativado. Posteriormente, o teste de tetrazolio foi realizado para analisar a viabilidade das sementes. O meio MS potencializou a germinabilidade de P. gounellei enquanto para S. luetzelburgii tanto os meio MS e MS/2 apresentaram resultados favoráveis. Para D. zehntneri o meio MS associado com carvão ativado reduziu o tempo médio de germinação. O carvão ativado reduziu o índice de velocidade de germinação (IVG) para P. gounellei. Por outro lado, para S. luetzelburgii o IVG foi maior em meio MS/2. O carvão ativado aumentou o vigor de todas as espécies estudadas. Novos estudos devem ser conduzidos a fim de esclarecer a causa da baixa germinabilidade das sementes de D. zenthneri e S. luetzelburgii.

Palavras-Chave: carvão ativado; dormência; estabelecimento in vitro; meio nutritivo; xique-xique.

Abstract

(In vitro germination of native cactaceae species from Bahia with ornamental potential). The in vitro establishment through seed germination allows the maintenance of genetic variability as well as the reduction in contamination rates during the beginning of cultures in an aseptic and controlled environment. Thus, the objective of this work was to analyze the effect of the culture medium and activated charcoal on the in vitro germination of Discocactus zehntneri, Stephanocereus luetzelburgii and Pilosocereus gounellei. For that, seeds collected in Morro do Chapéu and Mucugê, Chapada Diamantina - BA were stored and inoculated in agar and MS (MURASHIGUE and SKOOG, 1962) and MS with half the saline concentration (MS/2) supplemented with 30 and 15g L-1 of sucrose respectively, in the absence or presence (2 g L-1) of activated charcoal. Subsequently, the tetrazolium test was performed to analyze the viability of the seeds. MS medium potentiated the germinability of P. gounellei while for S. luetzelburgii both MS and MS/2 medium showed favorable results. For D. zehntneri, MS medium associated with activated charcoal reduced the mean germination time. Activated charcoal reduced the germination speed index (GVI) for P. gounellei. On the other hand, for S. luetzelburgii the IVG was higher in MS/2 medium. Activated charcoal increased the vigor of all studied species. New studies must be conducted in order to clarify the cause of the low germinability of D. zenthneri and S. luetzelburgii seeds.

Keywords: activated charcoal; dormancy; in vitro establishment; nutritive medium; xique-xique

1 Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Baiano. Rua Barão de Camaçari, 118 - Centro, CEP: 48110-000. Catu - BA, Brasil.

2 Universidade Federal da Bahia. Rua Barão de Jeremoabo, 668 - Ondina, CEP: 40170-115. Salvador - BA, Brasil.

3 Universidade Federal da Bahia. Rua Barão de Jeremoabo, 668 - Ondina, CEP: 40170-115. Salvador - BA, Brasil.

4 Universidade Estadual de Feira de Santana. Avenida Transnordestina, S/Nº, Bairro Novo Horizonte, CEP: 44036-900, Feira de Santana – BA, Brasil.

5 Universidade Federal da Bahia. Rua Barão de Jeremoabo, 668 - Ondina, CEP: 40170-115. Salvador - BA, Brasil.

Introdução

A germinação envolve diversas etapas que se inicia com a embebição de água pela semente e finaliza com a emergência da radícula (BEWLEY; BLACK, 1994). Tanto a capacidade (germinabilidade) quanto velocidade (vigor) deste processo sofre influência de diversos fatores, como a temperatura, luminosidade, potencial hídrico, viabilidade e dormência (ROJAS-ARÉCHIGA et al. 2001; KERBAUY, 2004). Devido à ausência de um padrão claro sobre os mecanismos que promovem a germinação de espécies da família Cactaceae (ROJAS-ARÉCHIGA et al. 2011) são necessários o estabelecimento de protocolos específicos, sobretudo para espécies nativas, uma vez que quase todas as publicações se referem a espécies de outros centros de diversidade (SILVA et al., 2011).

Discocactus. zehntneri, Pilosocereus. gounellei e Stephanocereus luetzelburgii, são espécies de cactáceas nativas do Estado da Bahia e que apresentam potencial ornamental. Tendo em vista que a coleta de muitas espécies desta família ocorre de forma extrativista, ferramentas biotecnológicas podem favorecer uma rápida multiplicação e, consequentemente, contribuir para a conservação dessas espécies.

A utilização da micropropagação para a conservação das espécies com algum tipo de ameaça deve assegurar a manutenção da variabilidade genética. Portanto, para o estabelecimento in vitro é interessante a utilização de plantas oriundas da germinação in vitro de sementes derivadas de diferentes populações (MERCIER; NIEVOLA, 2003). A utilização de sementes para estabelecimento in vitro de plantas também assegura maior facilidade na desinfestação quando comparado à utilização de tecidos extraídos de plantas nativas cuja morfologia, repleta de espinhos e pelos, facilita a presença de uma grande variedade de microorganismos (MERCIER; KERBAUY, 1994; CHÁVEZ; RUBIO; NEÁVEZ, 2006; MEDEIROS et al., 2006).

MARCHI et al. (2013) com o objetivo de analisar a criopreservação de sementes de D. zehntneri, S. luetzelburgii e P. gounellei verificou que após 26 dias de inoculação em papel germitest as duas primeiras espécies não apresentaram germinabilidade e a última obteve 60% de germinação. VEIGA-BARBOSA et al. (2010) também relatou ausência de germinação em condições similares para D. zehtneri.

Tendo a vista a necessidade de compreender como ocorre a germinação e crescimento in vitro destas espécies para subsidiar estudos mais avançados no que tange a multiplicação das mesmas, este trabalho teve como objetivo analisar o efeito do meio de cultura e carvão ativado no estabelecimento in vitro de D. zehntneri, S. luetzelburgii e P. gounellei.

Material e Métodos

Material vegetal Frutos maduros de D. zehntneri, P. gounellei e S. luetzelburgii foram coletados em diferentes populações nos municípios de Morro do Chapéu e Mucugê, Chapada Diamantina - BA. Após serem retiradas dos frutos, as sementes foram secas em papel de filtro, beneficiadas e posteriormente armazenadas em sacos de papel à temperatura ambiente até a instalação dos experimentos. Para os ensaios de germinação, as sementes foram desinfestadas quimicamente por um minuto álcool absoluto e 15 minutos em hipoclorito de sódio (2,5% de cloro ativo) e, em seguida, lavadas três vezes em água estéril. O experimento de germinação foi instalado de dois a quatro meses após a coleta das sementes.

Efeito do meio de cultura e do carvão ativado na germinação de sementes in vitro

Sementes de D. zehntneri, P. gounellei e S. luetzelburgii previamente desinfestadas foram inoculadas em frascos de vidro de 250 mL contendo 50 mL de água e ágar e dos meios MS e MS com metade da concentração salina (MS/2) suplementados com 30 e 15g L-1 de sacarose respectivamente, na ausência ou presença (2 g L-1) de carvão ativado. Os meios de cultura foram solidificados com 6,5 g L-1 de ágar, tiveram o pH aferido para 5,6 - 5,8 e foram esterilizados em autoclave por 15 minutos a 121°C.

Teste de tetrazólio para análise da viabilidade de sementes

O teste de tetrazólio para análise da viabilidade de sementes de D. zehntneri e S. luetzelburgii foi realizado segundo VEIGA-BARBOSA et al. (2010). Cinco repetições de 10 sementes tiveram o seu opérculo removido com o auxílio de um bisturi e, em seguida, foram submetidas a embebição em água por 24h. Posteriormente, as sementes foram imersas em solução de 2,3,5 trifenil cloreto de tetrazólio a 0,6% por 24h a temperatura ambiente. No dia seguinte, as sementes tiveram suas testas rompidas para análise da coloração do embrião a olho nu. Foram consideradas viáveis as sementes cujo embrião apresentou coloração avermelhada.

Variáveis analisadas, delineamento experimental e análise estatística

As avaliações foram diárias por no mínimo 28 dias e foi considerada germinada a semente cuja radícula apresentava mais de dois milímetros. As variáveis analisadas foram baseadas em SANTANA e RANAL (2000) e consistiram em: freqüência relativa de germinação (Fr), germinabilidade (%G), tempo médio de germinação (TMG), índice de velocidade de germinação (IVG) e coeficiente de uniformidade de germinação (CUG). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro repetições de 25 sementes cada em arranjo fatorial 3 x 2 (meios x carvão ativo). Com o objetivo atender as pressuposições da ANAVA, a germinabilidade, expressa em porcentagem, foi transformada em arcoseno (%G/100)0.5. Posteriormente, foi realizada a análise de variância e as médias foram comparadas pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade utilizando o programa estatístico Sisvar 5.1 (FERREIRA, 2008).

Condições de cultivo

Após a inoculação, as unidades experimentais foram mantidas em sala de crescimento com 25 ± 3º C sob luz fluorescente (60µmol –2 s –1) e fotoperíodo de 16 horas.

Resultados e discussão

Efeito do meio de cultura e do carvão ativado na germinação de sementes in vitro

A germinação estendeu-se do 8° ao 28° dia para Discocactus zehntneri (Figura 1A), do 5º ao 25º dia para Pilosocereus gounellei (Figura 1B) e do 3º ao 23º para Stephanocereus luetzelburgii (Figura 1C). As curvas de germinação para as três espécies apresentaram uma distribuição gradual, bastante espalhada no tempo, refletindo uma grande variância da germinação. Resultados similares foram obtidos na germinação de Turbinicarpus laui (ROSAS et al. 2001), T. laui, T. lophophoroides, T. pseudopectinatus, T. schmiedickeanus, T. subterraneus, T. valdezianus (DÁVILA-FIGUEROA; ROSA-CARRILLO; PÉREZ-MOLPHE-BALCH, 2005) e Pilosocereus robinii (QUIALA et al. 2009). Segundo BORGHETTI e FERREIRA (2004) esse tipo de comportamento fisiológico sugere que sob condições naturais, a germinação pode se estender de dias a meses. Espécies que apresentam este tipo de comportamento tendem a estabelecer banco de sementes persistentes e são típicas de ambientes com estresses ambientais.

O potencial para formação de bancos de sementes tem sido comumente relatado para muitas espécies de cactos (ROJAS-ARÉCHIGA; VÁSQUEZ-YANES, 2000; BENÍTEZ-RODRÍGUEZ et al. 2004; ORTEGA-BAES; ROJASARÉCHIGA, 2007; FLORES; JURADO; JIMÉNEZ-BREMONT, 2008; OLVERA-CARRILO et al., 2009; SÁNCHEZSOTO et al., 2010). Características como dormência, necessidade de um período de pós-maturação, resistência a patógenos, sementes pequenas, compactas e fotoblásticas positivas também favorecem o estabelecimento de um banco de sementes (ROJAS-ARÉCHIGA e BATIS, 2001; BENÍTEZ-RODRÍGUEZ et al. 2004). No entanto, apesar de estudos referentes à dinâmica de banco de sementes contribuírem para o entendimento da dinâmica de populações e estrutura das comunidades, poucos estudos têm sido realizados com representantes da família (ROJAS-ARÉCHI; BATIS, 2001).

O meio de nutritivo e o carvão ativado interferiram tanto no número de sementes germinadas quanto na cinética do processo germinativo. Não houve interação entre os fatores para a variável germinabilidade para nenhuma das espécies analisadas. Os fatores interferiram de forma isolada em P.gounellei e S. luetzelburgii. Para a primeira espécie os melhores

resultados ocorreram em MS (59%) e na presença de carvão ativado (61%) e, para a segunda, os meios nutritivos MS (15%) e MS/2 (17%) foram mais efetivos que o ágar (Tabelas 2-3).

Por outro lado, o tempo médio de germinação apresentou interação entre os fatores apenas para D. zenhtneri (Tabela 1). Neste caso, o meio MS associado com 2,0 g L-1 de carvão ativado reduziu significativamente esta variável de 17,62 para 4,44 dias, acelerando o processo germinativo.

Para o IVG não houve interação entre os fatores para a variável IVG para nenhuma das espécies analisadas. Assim como a germinabilidade, os fatores interferiram de forma isolada em P. gounellei e S. luetzelburgii. Para a primeira espécie o carvão ativado atuou reduzindo o IVG (0,872) e para a segunda o meio MS/2 (0,307) acelerou a cinética do processo germinativo (Tabela 2 e 3).

Figura 1. Freqüência relativa diária da germinação de sementes de Discocactus zehntneri (A), Pilosocereus gounellei (B) e Stephanocereus luetzelburgii (C). T1: ágar sem carvão; T2: ágar com carvão; T3: MS + 30g L-1 de sacarose sem carvão; T4: MS + 30g L-1 de sacarose com carvão; T5: MS/2 + 15g L-1 de sacarose sem carvão; T6: MS/2 + 15g L-1 de sacarose com carvão.

Tabela 1. Efeito do meio de cultura e do carvão ativado na germinabilidade (%G), tempo médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) na germinação de sementes de Discocactus zehntneri.

Carvão ativado

Meio nutritivo Ágar MS MS/2 Média geral Germinabilidade (%)

0 g L-1 6 aA 6 aA 5 aA 6 A

2,0 g L-1 8 aA 3 aA 10 aA 7 A Média Geral 7 a 5 a 8 a

TMG

0 g L-1 10,00 aA 17,62 aA 11,50 aA 10,48 A

2,0 g L-1 10,53 aA 4,44 aB 16,56 aA 13,04 A Média Geral 10,26 a 11,02 a 14,00 a

IVG

0 g L-1 0,135 aA 0,090 aA 0,117 aA 0,114 A 2,0 g L-1 0,100 aA 0,047 aA 0,170 aA 0,105 A Média Geral 0,117 a 0,068 a 0,143 a Médias seguidas por letras iguais, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05).

Tabela 2. Efeito do meio de cultura e do carvão ativado na germinabilidade (%G), tempo médio de germinação (TMG) e índice de velocidade de germinação (IVG) na germinação de sementes de Pilosocereus gounellei

Carvão ativado Meio nutritivo Ágar MS MS/2 Média geral Germinabilidade (%)

0 g L-1 49 bA 75 aA 58 abA 44 B 2,0 g L-1 37 aA 44 aB 50 aA 61 A Média Geral 43b 59a 54ab TMG

0 g L-1 14,46 aA 15,05 aA 13,09 aA 14,37 A 2,0 g L-1 15,37 aA 15,20 aA 13,89 aA 14,82 A Média Geral 15,17 a 15,12 a 13,49a IVG

0 g L-1 0,914 aA 1,514 aA 1,302 aA 1,243 A 2,0 g L-1 0,635 aA 0,898 aB 1,083 aA 0,872 B

Média Geral 0,775 a 1,207 a 1,191 a Médias seguidas por letras iguais, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05).

Tabela 3. Efeito do meio de cultura e do carvão ativado na germinabilidade (%G), tempo médio de germinação (TMG), índice de velocidade de germinação (IVG) na germinação de sementes de Stephanocereus luetzelburgii

Carvão ativado

Meio nutritivo Ágar MS MS/2 Média geral Germinabilidade (%)

0 g L-1 2 aA 12 aA 8 aB 7 A

2,0 g L-1 2 bA 17aA 25aA 15 A

Média Geral 2 b 15 a 17 a

TMG

0 g L-1 10,75 aA 18,25 aA 10,00 aA 13,00A

2,0 g L-1 9,25 aA 17,16 aA 14,97 aA 13,79A

Média Geral 10,00 a 17,70 a 12,48 a IVG

0 g L-1 0,022aA 0,170aA 0,197aA 0,130A 2,0 g L-1 0,027bA 0,267abA 0,417aA 0,337A

Média Geral 0,025 b 0,218 ab 0,307 a Médias seguidas por letras iguais, minúsculas nas linhas e maiúsculas nas colunas, não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05).

Elevadas concentrações de sais e sacarose reduzem o potencial hídrico do meio de cultura e consequentemente disponibilizam menos água para os estádios iniciais da germinação. Entretanto, nas espécies analisadas a restrição hídrica não influenciou na germinabilidade. Esses resultados corroboram os obtidos para a germinação de sementes de Turbinicarpus laui (ROSAS et al., 2001). Entretanto, para Pilosocereus robinii (QUIALA et al., 2009), Echinocactus platyacanthus e Polaskia chichipe (ROSAS-LÓPEZ; COLLAZO-ORTEGA, 2004), os resultados mais satisfatórios ocorreram em meios com maior potencial hídrico.

Os índices de germinação in vitro obtidos neste trabalho para as três espécies foram inferiores aos alcançados por outros representantes da família como Hamatocactus setispinus (XAVIER; JASMIM, 2015) Stenocereus queretaroensis (84,1%) (CHÁVEZ; RUBIO; NEÁVEZ, 2006), Ariocarpus kotschoubeyanus (70%) (MOEBIUS-GOLDAMMER; MATA-ROSAS; CHÁVEZ-AVILA, 2003), Turbinicarpus subterraneus (90%) (DÁVILA-FIGUEROA; ROSACARRILLO.; PÉREZ-MOLPHE-BALCH, 2005), Arrojadoa spp. (91,12%) (DIAS et al. 2008), Hylocereus polyrhizus (87%) (KARI et al., 2010) e Mammillaria mathildae (RUBIO; BARRERA, 2009). Baixas taxas de germinação, como as similares neste trabalho, foram obtidas para diversas espécies de cactáceas nativas (CIVATTI; MARCHI; BELLINTANI, 2017; VEIGA-BARBOSA, 2010) o que demonstra a necessidade de mais estudos para compreender a fisiologia da germinação destas espécies.

A baixa germinação pode ser atribuída à dormência e baixa viabilidade das sementes ou a fatores relacionados ao cultivo in vitro como inadequado protocolo de desinfestação e potencial osmótico do meio de cultura (MEDEIROS et al., 2006; RÊGO et al., 2009; VEIGA-BARBOSA et al., 2010).

O carvão ativado atuou de maneira diferenciada nas espécies em estudo (Tabelas 1-3). Quando associado ao meio MS, acelerou a germinação, reduzindo o TMG para quatro dias em D. zehntneri (Tabela 1). Por outro lado, para S. luetzelburgii reduziu a velocidade do processo germinativo (Tabela 3). Entretanto, para todas as espécies estudadas, o carvão ativado aumentou o vigor das plantas (Figura 2). Segundo PAN e STADEN (1998) o carvão ativado no cultivo in vitro além de tornar escuro o meio de cultura facilitando o enraizamento, adsorve substâncias inibitórias produzidas pelo

explante e meio de cultura bem como reguladores vegetais e outros compostos orgânicos, que podem contribuir para o aumento do vigor das plantas.

Durante a germinação, o carvão ativado pode neutralizar ou adsorver inibidores presentes nas sementes, como o ácido abscísico (ABA) e ácidos fenólicos, que limitam a habilidade de crescer do embrião (PEREZ, 2004), o que pode ter aumentado e acelerado a germinação das espécies. Em Arrojadoa spp. o carvão ativado também reduziu o TMG de sementes (DIAS et al. 2008), o que corrobora os resultados encontrados neste trabalho.

O CUG não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos para nenhuma das espécies analisadas neste trabalho (dados não apresentados em tabela). Esse resultado corrobora com os obtidos por CIVATTI; MARCHI; BELLINTANI (2015a) para germinação de Micranthocereus flaviflorus subsp. densiflorus, M. polyanthus subsp. alvinii e Melocactus conoideus, cujas sementes foram armazenadas sob diferentes condições de umidade e temperatura. No entanto, quando os mesmos autores analisaram a criopreservação de sementes destas espécies observaram que M. polyanthus apresentou uma redução deste coeficiente apenas nos tratamentos cujas sementes foram criopreservadas por 7 e 30 dias (CIVATTI; MARCHI; BELLINTANI, 2015b).

Teste de tetrazólio para análise da viabilidade de sementes

O teste de tetrazólio revelou que mais da metade das sementes de D. zehntneri e S. leutzelburgii apresentaram-se viáveis. Para S. luetzelburgii 88% dos embriões apresentaram coloração vermelha, 2% coloração rosa e 10% não foram corados. D. zehntneri apresentou uma menor porcentagem de embriões completamente corados, 60% vermelhos, 10% rosas e 30% brancos. Estes resultados associados a baixa germinabilidade in vitro sugerem que sementes de D. zehntneri e S. luetzelburgii devem apresentar algum tipo de dormência. VEIGA-BARBOSA et al. (2010) encontraram um maior percentual de embriões de D. zehntneri corados, cerca de 95±5, e, também atribuiu a baixa germinabilidade desta espécie a algum tipo de dormência associada a semente.

Considerações finais

Independente do meio nutritivo utilizado, D. zehnteri e S. luetzelburgii apresentaram baixa germinabilidade. Este estudo, assim como outros já realizados para estas espécies e/ou outras espécies nativas de cactos sugerem que a baixa germinabilidade pode estar associada a algum tipo de dormência, o que aponta para a necessidade de novas investigações a fim de esclarecer os mecanismos que promovem a germinação destas espécies. Considerando os custos para preparação dos meios nutritivos e os resultados obtidos sugere-se que a germinação de D. zehnteri ocorra em ágar e água, já para P. gounellei e S. luetzelurgii indica-se MS e MS/2, respectivamente. Considerando o vigor das espécies nos tratamentos com carvão ativado, indica-se a utilização deste aditivo para todas as espécies estudadas.

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Isolamento e identificação de metabólitos secundários de Polygala boliviensis A.W. Benn (Polygalaceae)

Resumo

A família Polygalaceae apresenta cerca de 27 gêneros e 1300 espécies, sendo o gênero Polygala o mais representativo no Brasil. Estudos com Polygala spp. apontam uma diversidade de metabólitos secundários e atividades biológicas, contudo poucos estudos químicos foram realizados com Polygala boliviensis. Assim, o objetivo do trabalho foi identificar metabólitos secundários produzidos por essa espécie. Para isso, partes aéreas e raízes foram coletadas em Feira de Santana, Bahia e seca em estufa. O material vegetal seco foi pulverizado em liquidificador industrial e submetido à maceração com metanol. O extrato metanólico bruto foi particionado sequencialmente com hexano, clorofórmio e acetato de etila, e a porção hexano submetida a sucessivos processos cromatográficos. A identificação das substâncias foi realizada por ressonância magnética nuclear de 1H e 13C uni e bidimensionais. Foram identificados o α-espinasterol e uma mistura de ácido palmítico e palmitato de metila. Esse é o primeiro relato do isolamento desses metabólitos em P. boliviensis. Dessa forma, o presente trabalho contribui para a quimiotaxonomia do gênero, bem como traz novas perspectivas para a avaliação biológica das substâncias isoladas.

Palavras-Chave: ácidos graxos; cromatografia; esteroides; ressonância magnética nuclear.

Abstract

(Isolation and identification of secondary metabolites from Polygala boliviensis A.W. Benn (Polygalaceae)). The Polygalaceae family has about 27 genera and 1300 species, with the Polygala genus being the most representative in Brazil. Studies with Polygala spp. point to a diversity of secondary metabolites and biological activities, however few chemical studies were carried out with Polygala boliviensis. Thus, the objective of this work was to identify secondary metabolites produced by this species. For this, aerial parts and roots were collected in Feira de Santana, Bahia and dried in an oven. The dried plant material was pulverized in an industrial blender and subjected to maceration with methanol. The crude methanolic extract was partitioned sequentially with hexane, chloroform and ethyl acetate, and the hexane portion was subjected to successive chromatographic processes. The identification of substances was performed by oneand two-dimensional 1H and 13C nuclear magnetic resonance. α-spinasterol and a mixture of palmitic acid and methyl palmitate were identified. This is the first report of the isolation of these metabolites in P. boliviensis. Thus, the present work contributes to the chemotaxonomy of the genus, as well as brings new perspectives for the biological evaluation of isolated substances.

Keywords: fatty acids; chromatography; steroids; nuclear magnetic resonance.

Introdução

A família Polygalaceae é representada por cerca de 29 gêneros e 1200 espécies descritas, até o momento, com ampla distribuição no mundo (PASTORE, 2019). No Brasil, está representada por 11 gêneros e 213 espécies, das quais, as espécies do gênero Polygala é o mais representativo (FLORA DO BRASIL, 2022).

1 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: dfsilva@uefs.br

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: carolanneps@gmail.com

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: lara.amanda@live.com

4 Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, R. Rui Barbosa, S/N, CEP 44380-000, Cruz das Almas, BA, Brasil. E-mail: veca_alves@hotmail.com

5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cleiroz@gmail.com

6 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, S/N, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.br

Investigações com espécies do gênero Polygala mostram interessantes propriedades farmacológicas, a exemplo da P. paniculata com efeito antinociceptivo opioide, anti-inflamatório, protetor gástrico (LAPA, 2006) e vasorrelaxante (LAPA et al., 2011); P. japonica, apresentando efeito neuroprotetor (LI et al., 2012); P. karensium, antiviral (DAO et al., 2012), P. sabulosa, como antidepressiva (CAPRA et al., 2010) e tripanocida (PIZZOLATTI et al., 2008); P. tenuifolia, utilizada para tratamento de amnésia, ansiedade, insônia, asma, bronquite (FANG et al., 2012) e como anti-inflamatória (CHEONG et al., 2011).

Estudos fitoquímicos mostram diversos metabólitos especiais no gênero Polygala, tais como saponinas triterpênicas (HUA; CHEN; ZHOU, 2010; LI et al., 2012), xantonas (DAO et al., 2012), cumarinas, flavonoides (CAPRA et al.,2010; PIZZOLATTI et al., 2008) e lignanas (DALL’ACQUA et al., 2002), além da presença de salicilato de metila, encontrado principalmente em suas raízes (ROCHA et al., 2012).

A espécie Polygala boliviensis A.W. Benn (Polygalaceae) é encontrada no Brasil, porém não é endêmica, sendo distribuída também em outros países da América do Sul (COELHO; AGRA; BARACHO, 2008; GÓMEZ, 2012; PASTORE et al., 2015b). Estudos anteriores relataram a presença de salicilato de metila nas partes aéreas e raízes de P. boliviensis (ROCHA et al., 2012), e das cumarinas, aurapteno e poligaleno (SILVA, 2015), o que demonstra uma importância farmacológica para a espécie. No entanto poucos estudos químicos foram realizados com P. boliviensis, assim, observa-se a importância da realização da identificação dos metabólitos secundários presentes nesta espécie, contribuindo dessa forma com a quimiotaxonomia da família e como alternativa na busca de novas substâncias ativas para o desenvolvimento de fármacos.

Nesse sentido, os objetivos do trabalho foram isolar e identificar metabólitos secundários do extrato metanólico das partes aéreas e raízes de P. boliviensis.

Material e Métodos

Material vegetal

A coleta foi realizada em julho de 2013, no campus da Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, Bahia. A autorização de acesso ao patrimônio genético vegetal foi obtida junto ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (AAE56F0) e o material foi identificado pelo botânico especialista na família Dr. Floriano Bârea Pastore, comparando o material coletado com a exsicata (HUEFS168956) depositada no herbário da mesma universidade.

Extração, isolamento e identificação

A extração e partição foram descritos em publicação anterior (SILVA, 2016).

A planta, partes aéreas e raízes, foi seca em estufa e, posteriormente, pulverizada (8,16 kg), sendo submetida a maceração com metanol, resultando no extrato bruto (EBPB – 1,66 kg). Em seguida, o EBPB foi particionado com hexano, clorofórmio e acetato de etila, resultando nos extratos hexânico (FHPB – 150,00 g), clorofórmico (FCPB - 291,11 g) e acetato de etila (FAPB – 4,2 g).

A fração hexânica (75,00 g) foi submetida a cromatografia em coluna com sílica gel e, como fase móvel, hexano:acetato de etila, resultando em 32 frações (FHPB01-FHPB32). A FHPB04 (3,2680 g) foi purificada utilizando a mesma fase estacionária, porém com sistema de gradiente com hexano:acetona, convertendo-se em 16 frações (FHPB04C01- FHPB04C16).

As frações FHPB04C02 a FHPB04C05 foram unidas, para aumentar a massa, e submetidas a cromatografia com gel de dextrana, como fase estacionária e, como fase móvel, clorofórmio:metanol (6:4), resultando em três frações (FHPB04C02S01- FHPB04C02S03). A FHPB04C02S03 foi submetida ao mesmo tipo de cromatografia e três frações foram obtidas (FHPB04C02S03(1)- FHPB04C02S03(3)).

A FHPB11 (4,3000 g) foi purificada por cromatografia com sílica gel e sistema de gradiente com hexano:acetona, gerando 11 frações (FHPB11C01- FHPB11C11). A fração FHPB11C05 (0,8948g) apresentou precipitado, porém para purificálo foi necessário submetê-la a nova CC, nas mesmas condições da anterior, que resultaram em quatro frações (FHPB11C05C01-FHPB11C05C04). AFHPB11C05C02 apresentou precipitado (FHPB11C05C02a) que foi purificado por trituração química com acetona.

Os precipitados obtidos foram avaliados por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) (uma e duas dimensões), conduzida em Espectrômetro INOVA 500 operando a 500 MHz (1H) ou Espectrômetro Bruker™ 400 MHz ASCEND III a 400 MHz (1H), e a 125 MHz (13C), usando clorofórmio como solvente, e tetrametilsilano (TMS) como padrão interno.

Resultados e Discussão

As estruturas químicas das substâncias isoladas foram propostas através de dados de RMN uni e bidimensionais e em comparação com a literatura, quando possível.

FHPB04C02S03(3)

FHPB04C02S03(3) (65,9 mg) foi isolado na forma pastosa e com coloração branca. A partir da análise dos espectros de RMN uni e bidimensionais (Tabela 1) foi possível verificar a presença de sinais característicos de substâncias alifáticas. Os dados observados sugerem que a fração corresponde a uma mistura de ácido palmítico, de fórmula molecular C16H32O2, e palmitato de metila, C17H34O2 (Figura 1).

Tabela 1. Sinais de RMN de 1H e de 13C da FHPB04C02S03(3) Ácido palmítico Palmitato de metila

Posição δ13C e δ1H (m;J) δ13C e δ1H (m;J) 1 178,95 174,41 2 33,87; 2,34 (dt; 6,5; 7,5; 8,0) 33,87; 2,34 (dt; 6,5; 7,5; 8,0) 3 24,70; 1,65 (q; 7,0; 7,5) 24,70; 1,65 (q; 7,0; 7,5) 4-15 1,28 (s) 1,28 (s) 16 14,10; 0,90 (t; 7,0) 14,10; 0,90 (t; 7,0) 1’ -2’ - 51,37; 3,69 (s)

Espectros foram analisados em clorofórmio a 500 MHz (1H) e 125 MHz (13C). m representa a multiplicidade, valores de J estão entre parênteses e reportados em Hz; sinais químicos estão em ppm. Fonte: os autores.

Figura 1. Estrutura química do ácido palmítico (A) e do palmitato de metila (B). Fonte: autores.

O espectro de RMN de 1H mostrou sinais característicos de ácidos graxos, como δ0,90 (3H, t, H16, J = 7,0 Hz) referente aos hidrogênios metílicos terminais; δ1,28 (24H, s, H4-H15) aos hidrogênios metilênicos (-CH2)n; δ1,65 (2H, q, H3, J = 7,5 Hz; J = 7,0 Hz) que foi atribuído aos hidrogênios metilênicos β à carbonila; e δ2,34 (2H, dt, H2, J = 7,5 Hz; J = 7,0 Hz; J = 8,0 Hz) referente aos hidrogênios metilênicos α à carbonila (BARCELOS, 1997). Foi observado também um sinal em δ3,69 (3H, s, H2’), característico da presença de éster metílico (PIEREZAN, 2015).

O espectro de RMN 13C permitiu identificar dois sinais característicos de carbonilas em δ174,41 e δ178,95, cada sinal referente a uma estrutura, como confirmado no HMBC. Foram observados também sinais em δ14,10 e δ51,43 que, através da análise do DEPT 135 foram atribuídos à metila terminal (SAVI, 2009) e ao carbono metoxílico do éster, respectivamente, já que se apresentaram como os únicos sinais positivos. Os demais sinais de carbono, apresentaram-se entre 20 e 40 ppm, sendo que, no DEPT 135, mostraram-se como sinais negativos e foram atribuídos aos carbonos metilênicos.

O HMQC confirmou a correlação entre os sinais δ0,90 (H16) e δ14,10 (C16); δ1,65 (H3) e δ24,70 (C3); δ2,34 (H2) e δ33,87 (C2); e δ3,69 (H2’) e δ51,37 (C2’). O espectro de HMBC permitiu observar correlações entre δ3,69 (H2’) e δ174,41 (C1), confirmando que esse sinal de carbono se refere a carbonila do éster. Foi observada também correlação dos hidrogênios metilênicos δ2,34 (H2) e δ1,65 (H3) com os sinais das carbonilas δ174,41 e δ178,95, confirmando que esses referem-se aos hidrogênios α e β às carbonilas. Além disso, há correlação entre δ2,34 (H2) e δ24,70 (C3) e vice-versa, δ1,65 (H3) e δ33,87 (C2), mostrando proximidade entre os mesmos. Outras correlações também foram observadas entre os hidrogênios metilênicos δ1,28 (H4-H15) e dos hidrogênios metílicos terminais δ0,90 (H16) com diferentes carbonos metilênicos da cadeia alifática.

Muitos ácidos graxos e ésteres desses ácidos apresentam sinais similares quando analisados por RMN, dessa forma, essa técnica não é suficiente para avaliar a pureza da amostra. Sendo assim, para a identificação inequívoca, é necessária análise adicional por Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massas. No entanto, com base na sugestão que a amostra corresponde a mistura do ácido palmítico com o palmitato de metila, a porcentagem relativa dos componentes foi deduzida através da análise da integração dos hidrogênios como descrito na literatura (GOULART et al., 1993).

O cálculo tomou como base a integração dos sinais correspondentes a H16, metila presente nas duas estruturas, cuja intensidade relativa foi de 3,18; e do H2’, metoxila presente apenas no éster, com intensidade relativa de 1,0. O valor de 1,0 representa a integração para três hidrogênios do palmitato de metila, assim subtraindo esse valor de 3,18, obtém-se a intensidade correspondente aos três hidrogênios do ácido palmítico, que seria de 2,18. Tomando-se a intensidade relativa de 3,18 como 100% da mistura, é possível deduzir que há 68,55% de ácido palmítico e 31,45% de palmitato de metila.

O ácido palmítico é um ácido graxo saturado, que juntamente com o ácido esteárico e os ácidos insaturados oleico e linoleico são predominantes nas plantas superiores (SAVI, 2009). Em P. boliviensis o ácido palmítico foi isolado com o éster metílico desse ácido, o palmitato de metila. Esse ácido graxo foi descrito também para a Polygala arillata (XIANG et al., 2019). De acordo com SALISU, OKPUZOR e JAJA (2019) o ácido palmítico apresenta efeitos antioxidantes, antiaterosclerótico e hipocolesterolêmico.

FHPB11C05C02a

FHPB11C05C02a (20,9 mg) foi isolado como pó de coloração branca que foi identificado como o esteroide αespinasterol, de fórmula molecular C29H48O (Figura 2).

Figura 2. Estrutura química do α-espinasterol. Fonte: autores.

A tabela 2 mostra os sinais encontrados nas técnicas de RMN. O espectro de RMN de 1H mostrou perfil característico de esteroides. Foram observados sinais referentes a hidrogênios metílicos, sendo eles: um singleto em δ0,55 (3H, s,H18),dubletoem δ0,85(3H, d, H26, J =6,4Hz)eδ1,03(3H, d, H21, J= 6,8 Hz). Também foi observado multipleto em δ0,81 (9H, m) que, segundo PINHEIRO (1996), referem-se aos hidrogênios das demais metilas, ou seja, H19, H27 e H29.

Tabela 2. Sinais de RMN de 1H e de 13C, correlações bidimensionais da FHPB11C05C02a e comparação com a literatura Posição Presente estudo* Pinheiro (1996) CDCl3 δ13C e δ1H (m;J) δ13C e δ1H (m;J) 1 37,14; nd 37,09; nd 2 31,47; nd 31,41; nd 3 71,07; 3,60 (m) 71,03; 3,59 (m) 4 37,99; nd 37,92; nd 5 40,26; nd 40,20; nd 6 29,64; nd 29,59; nd 7 117,46; 5,16 (m; 6,8; 2,4) 117,42; 5,14 (m) 8 139,57; - 139,52;9 49,44; nd 49,38; nd 10 34,22; - 34,17;11 21,55; nd 21,51; nd 12 39,46; nd 39,41; nd 13 43,29; - 43,24;14 55,13; nd 55,08; nd 15 23,02; nd 22,99; nd 16 28,52; nd 28,50; nd 17 55,89; nd 55,82; nd 18 12,06; 0,55 (s) 12,03; 0,55 (s) 19 13,06; 0,81 (m) 13,03; 0,79 (s) 20 40,85; nd 40,83; nd 21 21,38; 1,03 (d; 6,8) 21,36; 1,02 (d; 6,6) 22 138,18; 5,16 (m; 8,4; 15,2) 138,16; 5,16 (dd; 8,8; 15,2) 23 129,43; 5,02 (dd; 8,8; 15,2) 129,37; 5,03 (dd; 8,8; 15,2) 24 51,25; nd 51,21; nd 25 31,88; nd 31,85; nd 26 21,11; 0,85 (d; 6,4) 21,09; 0,85 (d; 6,3) 27 19,00; 0,81 (m) 18,96; 0,80 (d; 6,4) 28 25,41; nd 25,38; nd 29 12,26; 0,81 (m) 12,24; 0,80 (t; 7,3)

*Espectros foram obtidos em clorofórmio a 400 MHz (1H) e 125 MHz (13C). m representa a multiplicidade, valores de J estão entre parênteses e reportados em Hz; sinais químicos estão em ppm; nd corresponde a sinais de não descritos. Fonte: autores.

Observa-se, ainda, um triplo tripleto em δ3,60 (1H, tt, H3) referente ao próton carbinólico, duplo dubleto em δ5,02 (1H, dd, H23) com constante de acoplamento vicinal de 8,8 Hz e característica de ligação dupla trans dissubstituída 15,2Hz, e multipleto em δ5,16 (2H, m, H22 e H7) que apresentou Jvicinal de 8,4 Hz e trans Jde 15,2Hz, referente a cadeia lateral. Outras constantes de acoplamento desse multipleto foram atribuídas ao H7, J = 6,8 Hz e J = 2,4 Hz, características de hidrogênios orto e meta relacionados.

Os espectros de RMN 13C afirmam a presença de 29 carbonos, sendo seis metilas, δ12,06 (C18), δ13,06 (C19), δ21,38 (C21), δ21,11 (C26), δ19,00 (C27) e δ12,26 (C29); nove metilenos, δ37,14 (C1), δ31,47 (C2), δ37,99 (C4), δ29,64 (C6), δ21,55 (C11), δ39,46 (C12), δ23,02 (C15), δ28,52 (C16) e δ25,41 (C28); oito carbonos metínicos, δ71,07 (C3, ligado a hidroxila), δ40,26 (C5), δ49,44 (C9), δ55,13 (C14), δ55,89 (C17), δ40,85 (C20), δ51,25 (C24) e δ31,88 (C25); dois carbonos quaternários δ34,22(C10) eδ43,29(C13); e sinais em δ117,46 (C7), δ139,57 (C8), δ138,18 (C22) e δ129,43 (C23) que indicam a presença de ligações duplas, sendo o deslocamento químico em δ138,57 referente a uma dupla trissubstituída e os demais, às duplas dissubstituídas.

A comparação os dados de RMN obtidos com o trabalho de Pinheiro (1996) levaram a concluir que a substância se trata do α-espinasterol, que é um esteroide encontrado em poucas espécies, dentre elas espécies da família Polygalaceae, como Bredemeyera floribunda (PINHEIRO, 1996), e, recentemente descrito em espécies de Polygala encontradas no Brasil, a exemplo da P. altomontana (TIZZIANI et al., 2018a), e de P. campestris, P. densiracemosa, P. linoides e P. pulchella (TIZZIANI et al., 2018b). Quando isolado de P. sabulosa apresentou efeito anti-inflamatório comparado com a dexametasona (LACAILLE-DUBOIS, DELAUDE, MITAINE-OFFER, 2020).

Conclusão

A espécie Polygala boliviensis apresenta em sua composição química o α-espinasterol, ácido palmítico e palmitato de metila. Esse é o primeiro relato do isolamento desses componentes na espécie.

O conhecimento químico da espécie contribui com a quimiotaxonomia do gênero Polygala e da família Polygalaceae, e traz novas perspectivas para a avaliação biológica das substâncias isoladas, ressaltando assim o potencial medicinal da P. boliviensis e a importância da caracterização e conservação desse promissor recurso genético vegetal do semiárido baiano.

Agradecimentos

À FAPESB e a CAPES pelo apoio financeiro.

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1

Morfogênese in vitro de duas espécies de orquídeas da Chapada Diamantina-BA

Resumo

A Chapada Diamantina localiza-se na Bahia e possui alta diversidade florística e endemismo. A região apresenta uma grande diversidade de orquídeas, dentre elas Cattleya elongata e Cyrtopodium flavum, que sofrem com o extrativismo predatório e perda de hábitat. A cultura de tecidos vegetais possibilita a multiplicação e conservação in vitro de tais espécies. Este trabalho teve como objetivo analisar a influência da sacarose presente no meio de cultura no desenvolvimento in vitro de C. elongata. e C. flavum. Para tanto, foi utilizado o meio nutritivo Murashige e Skoog (MS), com quatro concentrações de sacarose (30, 45, 60 e 75 g L-1). Ao final de 210 dias foram avaliados sobrevivência, calogênese, número de raízes e folhas, comprimento da maior raiz, número de brotos e peso seco. C. elongata, mostrouse menos sensível às concentrações de sacarose testadas que a C. flavum, para o qual se recomenda o uso de 30 g L-1 do carboidrato. Para C. flavum pode-se induzir 66,6% de embriogênese somática indireta para os explantes testados, a partir do tratamento com 45 g L-1 de sacarose, sem o uso de reguladores vegetais. O crescimento lento é alcançado para essa espécie, mantendo-se as culturas em meio acrescido de 75 g L-1 de sacarose. Palavras-chave: calogênese; Cattleya elongata; crescimento lento; Cyrtopodium flavum; embriogênese somática.

Abstract

(Effect of sucrose on in vitro cultivation of two orchid species of Chapada Diamantina-BA). Chapada Diamantina is a region in Bahia, which exhibits high floristic diversity as well as high endemism levels. This area presents a large diversity of orchids, amongst them Cattleya elongata and Cyrtopodium flavum that suffer with extractivism and habitat loss. The plant tissue culture methods allow the multiplication of these species and their in vitro conservation. Then, the goal of this current study was to evaluate the influence provided by the presence of sucrose on the nutritive medium in in vitro growth of C. elongata. and C. flavum. For such purpose, the Murashige e Skoog nutritive medium was used (autoclaved by 15 min under 121°C), presenting four different sucrose concentrations (30, 45, 60 e 75 g L-1). At the end of 210 days, survival, callogenesis, number of roots and leaves, length of the largest root, number of shoots and dry weight were evaluated. C. elongata was less sensitive to sucrose concentrations tested in the culture medium than C. flavum, for which the use of 30 g L-1 of carbohydrate is recommended. Thus, it is recommended a concentration of 30 g L-1 of sucrose for this less sensitive species. Furthermore, it was possible to induce somatic embryogenesis in C. flavum, that was observed 66.6% on the treatment with 45 g L-1 of sucrose without any vegetal regulators added on the medium. The slow growth for this species is possible when keeping the cultivars on nutritive medium with concentration of 75 g L-1 of sucrose.

Key words: callogenesis; Cattleya elongata; Cyrtopodium flavum; low growing; somatic embryogenesis.

Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: gustavo_surlo@yahoo.com.br

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil.

3 Instituto Federal Baiano, Rua Barão de Camaçari, n 118, 48110000, BA- Brasil; E-mail: marchi.mng@gmail.com

4 Universidade Federal da Bahia, R. Barão de Geremoabo, s/n, 40117011, BA-Brasil.

5 Universidade Federal da Bahia, R. Barão de Geremoabo, s/n, 40117011, BA-Brasil.

6 Universidade Federal da Bahia, R. Barão de Geremoabo, s/n, 40117011, BA-Brasil; E-mail: alessandra.schnadelbach@gmail.com

Introdução

A Chapada Diamantina está localizada ao Norte de uma cadeia de montanhas denominada Cadeia do Espinhaço, que se estende da Serra do Ouro branco em Minas Gerais até a Serra da Jacobina, no Nordeste da Bahia. Em sua extensão, pode-se encontrar um tipo vegetacional denominado Campo Rupestre (RAPINI et al., 2008).

Inseridos nos biomas Cerrado e Caatinga, os campos rupestres ocorrem a partir de 900 metros de altitude (RAPINI et al., 2008), onde há predominância de monocotiledôneas, as quais acumularam características únicas para sobreviver às condições de exposição a oscilações drásticas de temperatura, solos oligotróficos e ácidos além de restrições hídricas nestes ambientes (GIULIETTI et al., 1987). A riqueza de espécies nos campos rupestres é justificada pelo padrão disjunto desse tipo de vegetação que associado ao seu isolamento conduz as populações a eventos de especiação, gerando altas taxas de endemismo neste ambiente (RAPINI et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008).

Os campos rupestres estão presentes ao longo da Chapada Diamantina, onde a família Orchidaceae possui grande representatividade (VIEIRA; BARROS; ROQUE, 2014). Dentro deste grupo, encontra-se Cyrtopodium flavum Link & Otto e Cattleya elongata Barb. Rodr., espécies que ocorrem nos campos rupestres e sofrem com a perda de hábitat devido à ação antrópica (RAPINI et al., 2008). Além disso, o extrativismo predatório, induzido pelo alto valor ornamental destas plantas, também coloca as espécies em risco. Ambas as espécies constam no Convention on International Trade in Endangered Species of wild Fauna and Flora- CITES (2017), que regula o comércio de espécies em perigo de extinção. Neste cenário, A cultura de tecidos vegetais pode possibilitar tanto a propagação quanto a conservação in vitro destas espécies (DÍAZ; GARCIGLIA, 2013; SILVA, 2016) e contribuir para diminuir os impactos aos quais as mesmas vêm sendo submetidas.

Na micropropagação, a morfogênese pode se dar através da organogênese ou da embriogênese, ambas podendo ocorrer pela rota direta (sem a presença de calos), ou indireta (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Na organogênese há o surgimento de tecidos que se diferenciam a partir de calos (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Já na embriogênese, células somáticas geram embriões análogos aos embriões zigóticos (AMMIRATO, 1983). Embora a embriogênese possa gerar maiores quantidades de plantas quando comparada à organogênese, nem todas as espécies se mostram responsivas a esta técnica. Também há relativa dificuldade na obtenção de sistemas de embriogênese reproduzíveis em larga escala (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; SHAHZAD et al., 2017).

Atualmente se julga essencial o uso de reguladores vegetais para que a morfogênese ocorra em Orchidaceae (BUSTAM et al., 2017, ROMERO et al., 2017; RIVA et al., 2017; MIRANI et al., 2017; NAHAR et al., 2017; JAINOL et al., 2017; ARAFA et al., 2021). No entanto, essas substâncias têm preço elevado e tendem a aumentar as chances de variações genéticas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998; BAIRU et al., 2011).

Para conservação, o método de crescimento lento objetiva a redução das taxas metabólicas do explante, possibilitando o armazenamento de germoplasma a curto e médio prazo, reduzindo os custos advindos da cultura (SHAHZAD et al., 2017). Para tal, destaca-se o uso do agente osmótico sacarose. Com baixo custo, a sacarose modifica o potencial hídrico do meio, disponibilizando menos água para a célula e tornando o desenvolvimento mais lento (ARRIGONI-BLANK et al., 2014).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de sacarose na morfogênse in vitro de protocormos de C. elongata e C. flavum

Material e Métodos

A montagem e condução dos experimentos ocorreu no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV) e Laboratório de Anatomia Vegetal e Identificação de Madeiras (LAVIM) do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia (UFBA). Protocormos de C. elongata e C. flavum foram usados como explantes no estudo, sendo provenientes do banco ativo de germoplasma (BAG) in vitro do LCTV.

Quatro concentrações de sacarose foram testadas, 30, 45, 60 e 75 g L-1. O meio nutritivo utilizado foi o MS (Murashige e Skoog, 1962), acrescido de 1% de Inositol, 1% de Solução F (FeSO4.7H2O – 27,8 mg.L-1 e Na2EDTA –37,2 mg.L-1 ) e 2% de carvão ativado, sem adição de qualquer regulador vegetal. O pH do mesmo foi ajustado para 5,7 antes da autoclavagem que se deu por 15 min a 121°C. O meio foi distribuído em tubos de ensaio, com capacidade de 50 ml, sendo distribuídos 15 ml de meio por tubo. A inoculação dos explantes se deu dentro de câmara de fluxo laminar, e as culturas foram mantidas em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, intensidade luminosa de 60 µmol m-2 s1 e temperatura de 25 ± 2°C.

O delineamento foi inteiramente casualisado em esquema fatorial 2x4 (espécie x quantidades de sacarose), apresentando 6 repetições com 5 amostras cada, em cada tratamento. Os dados foram submetidos à análise da variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A análise estatística dos dados foi realizada com auxílio do programa Sisvar 5.1 (FERREIRA, 2011).

Registros fotográficos foram realizados em todos os tratamentos a cada 42 dias. Ao final de 210 dias as variáveis analisadas foram sobrevivência (%), calogênese (%), número de raízes/explante, número de folhas/explante, comprimento da maior raiz (cm) e número de brotos/explante. Após a avaliação dos parâmetros supracitados, as plantas foram secas, em estufa a 60°C por 90 horas e posteriormente pesadas, para obtenção do peso seco.

A análise anatômica do material foi feita a partir de duas amostras de cada tratamento as quais foram emblocadas utilizando resina histológica sintética (Leica historesin). As amostras foram fixadas em FAA70 (formaldeído, ácido acético e etanol 70%, 1:1:18, v/v) por 160 horas e desidratadas em série etílica crescente de 70% por uma hora e 80%, 90%, 100% por duas horas cada. Posteriormente, o material foi imerso em álcool 100% e resina pura (1:1) por duas horas e por fim em resina ativada durante 48 horas. As amostras foram dispostas em resina de inclusão (resina ativada + endurecedor) e alocadas em estufa a 50 °C para polimerização. O material foi seccionado em micrótomo rotativo (Thermo scientific –HM 325), gerando cortes com cinco micrômetros de espessura. Os cortes foram dispostos em lâminas, corados com azul de toluidina a 0,5%, por cinco minutos e fixados em Entellan®. As lâminas foram observadas em microscópio óptico Olympus CX41.

Resultados e Discussão

Em relação à variável sobrevivência C. elongata não apresentou diferença significativa entre os tratamentos, variando de 80% a 46,6%. Entretanto, C. flavum, mostrou maior sobrevivência (93,3%) no tratamento com 30 g L-1 de sacarose. Já em 60 g L-1, quando a quantidade de sacarose dobrou, foi observado uma redução na porcentagem de sobrevivência para essa espécie (53,3%). Entre espécies, houve diferenças significativas apenas para a concentração de 75 g L-1 de sacarose, onde C. flavum apresentou percentual de sobrevivência maior que C. elongata (Tabela 1).

Embora o meio testado não tenha tido a adição de reguladores vegetais, a calogênese foi registrada para C. elongata e C. flavum (Tabela 1), não havendo interação significativa entre espécie e sacarose. No entanto, C. elongata apresentou taxas de calogênese inferiores as de C. flavum, para todas as quantidades de sacarose estudadas. C. flavum apresentou altas taxas de calogênese, as quais alcançaram 66,6 % na concentração de 45 g L-1 de sacarose, não havendo diferença estatística dos demais.

Ambas as espécies geraram calos que regeneravam plantas bem formadas após 210 dias. Porém a morfologia e dinâmica de crescimento dos calos diferiram entre as espécies. Para C. elongata verificou-se a presença de calos esverdeados (Figura 1a) com crescimento acelerado que se diferenciavam espontaneamente em brotos, caracterizando processo de organogênese indireta (Figura 1b-c). A presença de calos nesse estudo é atribuída ao fator genético do explante utilizado. Tendo em vista que os explantes de C. elongata utilizados no estudo possuíam alta diversidade genética, em razão de serem oriundos do BAG, respostas distintas às condições de cultivo eram esperadas (SILVA; WINARTO, 2016). Tal resultado é muito positivo, pois a calogênese não é uma rota muito visada em Orchidaceae.

Tabela 1. Efeito de diferentes concentrações de sacarose sobre a porcentagem de sobrevivência, formação de calos, número de brotos, número de folhas, número de raízes, comprimento da maior raiz e peso seco das estruturas derivadas de protocormos de C. elongata e C. flavum.

Sobrevivência (%)

Sacarose (g L-1) C. elongata C. flavum Média geral 30 80,0 aA 93,3 aA 86,6 A 45 76,6 aA 66,6 aAB 71,6 A 60 71,6 aA 53,3 aB 62,5 A 75 46,6 bA 76,6 aAB 61,6 A Média geral (%) 68,7 a 72,5 a

Formação de calos (%)

Sacarose C. elongata C. flavum Média geral 30 3,3 bA 63,3 aA 33,3 A 45 0,0 bA 66,6 aA 33,3 A 60 6,6 bA 43,3 aA 25,0 A 75 0,0 bA 37,6 aA 18,8 A Média geral (%) 2,5 b 52,7 a Número de brotos

Sacarose (g L-1) C. elongata C. flavum Média geral 30 2,37 bA 5,50 aA 3,93 A 45 1,36 bA 5,13 aAB 3,25 A 60 2,51 aA 2,90 aBC 2,70 AB 75 0,56 aA 1,70 aC 1,13 B Média geral 1,70 b 3,80 a Número de folhas

Sacarose (g L-1) C. elongata C. flavum Média geral 30 3,40 bA 7,76 aA 5,58 A 45 3,03 aA 4,50 aB 3,76 AB 60 2,76 aA 1,83 aBC 2,30 BC 75 1,80 aA 0,53 aC 1,16 C Média geral 2,75 a 3,65 a Número de raízes

Sacarose (g L-1) C. elongata C. flavum Média geral 30 2,02 aA 3,30 aAB 2,65 A 45 1,16 bA 3,47 aA 2,31 A 60 1,19 aA 1,58 aBC 1,38 AB 75 0,50 aA 0,16 aC 0,33 B Média geral 1,21 b 2,13a Comprimento da maior raiz (cm)

Sacarose (g L-1) C. elongata C. flavum Média geral 30 1,14 bA 1,86 aA 1,50 A 45 0,77 aAB 1,42 aA 1,09 A 60 0,63 bAB 1,45 aA 1,04 A 75 0,19 aB 0,06 aB 0,13 B Média geral 0,68 b 1,20 a Peso seco (g)

Sacarose (g L-1) C. elongata C. flavum Média geral 30 0,04 bA 0,43 aA 0,23 A 45 0,06 bA 0,37 aAB 0,21 A 60 0,02 aA 0,19 aB 0,10 A 75 0,04 aA 0,23 aAB 0,14 A

Média geral 0,04 b 0,30 a Médias seguidas pela mesma letra, minúscula nas linhas e maiúsculas nas colunas para cada parâmetro, não diferem significativamente entre si pelo teste Tukey (p>0,05).

A regeneração de orquídeas a partir de calos é altamente variável de acordo com a espécie, geralmente ocasionando calos que apresentam baixas taxas de crescimento ou necrose frequente (KERBAUY, 1984; HONG et al., 2008; KAEWUBON, et al., 2015).

A confirmação da rota organogênica indireta, ao partir do estudo anatômico, permitiu observar que as porções superficiais do calo foram convertidas em meristemas, os quais originavam brotos (Figura 1d). Ocasionalmente conexões vasculares entre broto e o calo, fator tipicamente associado à organogênese indireta, foram constatadas (GUERRA; TORRES; TEIXEIRA, 1999; ROOSTIKA et al., 2016).

Figura 1. Organogênese

indireta em Cyrtopodium flavum (Amostras provindas do tratamento com 30 g L-1 de sacarose para C. elongata e 45 g L-1 de sacarose para C. flavum). a – Calos esverdeados de C. elongata (Barra = 1cm). b e c – brotos advindos de tecido calogênico de C. elongata (Barra =1cm). d- Broto (seta) oriundo do meristema provindo de tecido calogênico de C. elongata (Barra = 500µc). e - Calos esbranquiçados derivados de protocormos de C. flavum (barra-5mm), f – massa de calos amarelados de C. flavum, d - embriões diferenciados de C. flavum e e - plantas desenvolvidas de C. flavum (bar-1cm).

Já para C. flavum verificou-se que os calos obtidos geraram plantas bem desenvolvidas ao final de 210 dias, perpassando pela fase de corpos semelhantes a protocormos (CSP). Tal rota, caracterizou um processo de embriogênese somática indireta que ocorre em quatro estágios independentemente do tratamento.

Inicialmente o explante gerou massas calosas brancas ou levemente amareladas (Figura 1e), que aumentaram rapidamente de tamanho, tornando-se totalmente amareladas em períodos curtos de tempo, assim como observado por ZHAO (2008) para Dendrobium candidum.

Os calos amarelados apresentaram crescimento muito acelerado, chegando ao ponto de ocuparem toda a interface do meio de cultura presente no tubo em 42 dias em concentrações específicas de sacarose. Tais calos eram constituídos de massas relativamente compactas com textura granulosa em sua superfície (Figura 1f).

No estágio seguinte, houve uma diminuição no ritmo de crescimento das massas calosas. Os numerosos grânulos em sua superfície passaram a ter tonalidade esverdeada, diferenciando-se em CSP, como mostrado na Figura 1g. Essa diferenciação dos grânulos calosos em CSP sem a renovação do meio nutritivo é marcada pela provável diminuição dos níveis de sacarose disponível no mesmo, tendo em vista que a inoculação de calos em meio livre de sacarose promoveu a diferenciação dos mesmos como descrito para Phalaenopisis Richard Shaffer ‘Santa Cruz’ por ISHII et al. (1998).

Por fim, os CSP se diferenciavam em plantas completas, ainda sem a necessidade de renovação do meio de cultura (Figura 1h). As plantas geradas por essa rota alcançaram até 25 cm de altura, ao final do experimento.

A regeneração de orquídeas através de calos geralmente perpassa pelo processo de embriogênese somática, o qual gera CSP, em diversas espécies (AGILA; GUACHIZACA; CELLA, 2015; ULISSES, 2016; MOMTAJ et al., 2021). Um fator que fomenta a embriogênese somática na regeneração destas plantas é o fato dos protocormos serem tradicionalmente as primeiras estruturas formadas após a germinação das sementes nas orquídeas. Assim, o aparecimento de CSP reforça a ideia de uma fase embriogênica (ISHII, 1998; SILVA; WINARTO, 2016).

A comprovação efetiva da embriogênese somática indireta ocorreu através da análise anatômica dos calos amarelados, onde se verificou a presença de embriões globulares na superfície do tecido calogênico (Figura 2). Conexões vasculares entre o embrião e o explante não foram observadas.

Figura 2. Embrião somático derivado do corpo caloso. Amostra obtida do tratamento com 45 g L-1 de sacarose (Barra =500µc)

Verificou-se que os CSP podem se desenvolver em plantas, se mantidos no mesmo meio, ou dar origem a novos calos embriogênicos, perpassando pelas mesmas fases descritas anteriormente, quando subcultivados em meio fresco. Assim como visto por RAFIQUE et al. (2014) para Dendrobium sabin, altas porcentagens de embriogênese somática foram obtidas a partir de protocormos em meio livre de reguladores vegetais, ajustando-se para tal, apenas os níveis de sacarose no meio de cultura.

Para a variável número de brotos por explante houve interação significativa entre os fatores espécie e sacarose (p<0,05). Para C. elongata as concentrações de sacarose não diferiram estatisticamente entre si, variando de 2,51 a 0,56 brotos por explante (Tabela 1). Para C. flavum, o melhor tratamento foi o de 30 g L-1 com 3,93 brotos, apesar do mesmo não ter diferido estatisticamente dos tratamentos com 45 e 60 g L -1. Entre espécies, C. flavum apresentou maior número de brotos quando cultivados em meios com 30 e 45 g L -1 de sacarose.

Apesar de todos os tratamentos terem gerado calos para C. flavum, o número de brotos, advindos destes e a velocidade com que se desenvolviam variou, mostrando forte correlação com os níveis de sacarose presentes no meio. Esse fato foi constatado por análise visual e esquematizado na Figura 3.

Constatou-se que o estágio de desenvolvimento do explante presente em um meio com determinada quantidade de sacarose, era equivalente ao estágio imediatamente anterior de desenvolvimento do explante presente no tratamento com menos 15g/L -1 de sacarose, gerando fenômeno que se convencionou chamar de equivalência diagonal, indicado pelas setas na Figura 3. Havia assim, uma diminuição gradativa da velocidade de desenvolvimento entre os tratamentos à proporção que a concentração de sacarose aumenta. O que justifica tal padrão, onde meios com maior potencial hídrico promovem desenvolvimento mais acelerado do explante é o fato de que nestes, mais água fica disponível para as plantas e consequentemente, maiores as taxas de absorção de nutrientes por parte das mesmas (GALDIANO JUNIOR et al., 2013; PAULINO et al., 2023). Além disso, sabe-se que a disponibilidade de açúcares tem efeito importante sobre diversos genes do desenvolvimento (KOCH, 1996; HAQUE; NAHAR; KAZUHIKO, 2017).

Figura 3. Equivalência diagonal nos estágios de desenvolvimento de Cyrtopodium flavum

De forma geral, o meio com potencial hídrico mais elevado (30 g L -1 de sacarose) tendeu a apresentar não só taxas de desenvolvimento mais elevadas, como também mais aceleradas para ambas as espécies. De forma análoga, ao observado por GALDIANO JÚNIOR et al. (2013) para Cattleya violacea. Tal fenômeno, explica, em parte, os padrões vistos para as variáveis número de folhas por explante, número de raízes por explante e comprimento da maior raiz para ambas as espécies avaliadas.

Para a variável número de folhas por explante houve interação significativa entre os fatores espécie e sacarose (Tabela 1). Embora C. elongata não tenha apresentado diferença significativa entre os tratamentos, variando de 3,4 a 1,8 folhas por explante (Tabela 1), C. flavum, apresentou maior número de folhas em 30 g L-1, gerando 7,76 folhas por explante. Entre as espécies, observamos que só houve diferenças significativas na concentração 30 g L-1 de sacarose, na qual C. flavum apresentou maior número de folhas (7,76) que C. elongata (3,4).

Em relação à variável número de raízes por explante, também houve interação significativa entre os fatores espécie e sacarose (Tabela 1). A quantidade de sacarose presente no meio não influenciou na quantidade de raízes emitidas por explante para C. elongata. Já para C. flavum, os meios com 30 e 45 g L-1, apresentaram maior número de raízes (2,65 e 2,31), embora não haja diferença significativa destes para o meio com 60 g L-1. Entre espécies apenas o meio com 45 L-1 , apresentou significância, gerando um número superior de raízes (3,47) para C. flavum.

Paraavariávelcomprimentodamaiorraiz,houveinteraçãosignificativa(p≤0,05)entreosfatoresespécieesacarose (Tabela 1).C. flavum apresentou os melhores resultados nos meios acrescidos de 30 e 60 g L-1 de sacarose, com 1,86 e 1,45 cm, respectivamente.

C. elongata mostrou-se quase sempre menos responsiva à quantidade de sacarose presente no meio em relação a C. flavum, como se pode observar para as variáveis sobrevivência, número de brotos, número de folhas e número de raízes.

Para o peso seco, constata-se interação significativa entre os fatores espécie e sacarose (Tabela 1). C. elongata apresenta resultados inferiores a C. flavum nos meios com 30 e 45 g L-1

Analisando a Tabela 1 pode-se propor um viés conservacional para Cyrtopodium flavum, onde o uso do meio com 75 g L-1 de sacarose se mostra efetivo em promover o crescimento lento para a espécie sem afetar a viabilidade da mesma. A restrição hídrica aos explantes neste meio desacelera seu metabolismo, viabilizando a conservação ao manter-se bancos de germoplasma ativos em espaços reduzidos, por períodos prolongados e sem a necessidade de manutenção frequente (SILVA, 2016).

Conclusões

Cattleya elongata apresentou calos que regeneram plantas exclusivamente por organogênese indireta, enquanto a embriogênese somática se mostra mais comum em Cyrtopodium flavum.

A embriogênese somática de Cyrtopodium flavum é facilmente alcançada em meios com maior disponibilidade de água (30, 45 e 60g L -1 de sacarose), sendo dispensável o uso de reguladores vegetais. Já C. elongata se mostra menos responsiva e apresenta a rota organogênica indireta com mais regularidade.

Os corpos semelhantes a protocormos advindos da embriogênese somática de Cyrtopodium flavum, podem se diferenciar em plantas completas, se mantidas no mesmo meio de cultura, ou dar origem a novos calos embriogênicos se inoculados em meio fresco.

Cyrtopodium flavum apresenta taxas gerais de desenvolvimento maiores em meio com maior potencial hídrico. Já Cattleya elongata geralmente se mostra menos sensível às concentrações de sacarose presentes no meio de cultura.

O crescimento lento de Cyrtopodium flavum é alcançado com o uso de 75 g L -1 de sacarose, sem perda de viabilidade dos explantes.

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Potencial ornamental de Jatropha L. (Euphorbiaceae) no estado da Bahia, Brasil

Resumo

O gênero Jatropha L. pertence à família Euphorbiaceae e é composto por diversos representantes de grande importância econômica. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de identificar espécies desse gênero que ocorrem na Flora da Bahia e possuam características morfológicas apropriadas para uso no paisagismo, bem como disponibilizar as informações sobre suas características ornamentais. A avaliação das espécies foi realizada com base em características previamente estabelecidas e de acordo com aspectos considerados essenciais visando critérios que eliminassem ao máximo as preferências pessoais, seguindo as finalidades de uso. Foram reconhecidas 12 espécies de Jatropha ocorrentes na Bahia, todas elas com características que inferem uso potencial para o paisagismo, estimulando o uso dessas espécies, para as quais o potencial ornamental ainda é pouco explorado e valorizado. Sugere-se adicionalmente que sejam realizados estudos mais específicos, buscando estabelecer protocolos de regeneração e estabelecimento das plantas.

Palavras-Chave: flora da Bahia; paisagismo; importância econômica; uso potencial.

Abstract

(Ornamental Potential of Jatropha L. species (Euphorbiaceae) from Bahia State, Brazil.) The genus Jatropha belongs to the Euphorbiaceae family, and is composed of several representatives of great economic importance. The present work aimed to identify species of this genus that occur in the Flora of Bahia, and have appropriate morphologics characteristics for use in landscaping, as well as providing information about their ornamental characteristics. The species evaluation was carried out based on characteristics previously established and according to aspects considered essential, aiming at criteria that would eliminate personal preferences as much as possible, following the purposes of use. Twelve species of Jatropha occurring in Bahia were recognized, all of them having appropriate aesthetic characteristics which have potential for potential uses in landscaping, encouraging the use of those species, which ornamental potential is still little recognized and valued. Additionally, is suggested more specific studies, seeking to establish protocols for plant regeneration and establishment.

Keywords: flora of Bahia; landscaping; economic importance; potential use.

Introdução

O potencial ornamental de uma espécie deve considerar características morfológicas como copa ou tronco, arquitetura da planta, folha e flor (ou inflorescência), as quais são definidas em função de uma ou mais qualidades, como cor, forma, brilho, textura, quantidade, volume, tamanho, porte, dentre outros (LEAL; BIONDI, 2006). Para LEMOS (2016), a classificação de uma planta com potencial ornamental não é fácil, pois envolve gostos e sentimentos pessoais, já que as pessoas apreciam aspectos diversos. Além disso, é necessário reunir caracteres que atendam ao mercado, segundo JUNQUEIRA e PEETZ (2008), já que entre as tendências mais marcantes para a próxima década, está a maior diversificação do consumo, com introdução de espécies e cultivares mais adaptadas aos gostos e às culturas regionais.

Segundo MENEZES (2009), as plantas ornamentais se distinguem de outras espécies vegetais pelo aspecto geral, pela forma ou colorido das folhas e florescimento, preenchem espaços livres ou fechados sendo utilizadas no paisagismo de forma isolada ou em conjuntos. As plantas ornamentais produzem efeitos estéticos proporcionados pelas flores,

1 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, Novo Horizonte, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil E-mail: arianemoreiraasm@gmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, Novo Horizonte, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil. E-mail: dscarneiro@hotmail.com;

3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, Novo Horizonte, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brazil. E-mail: crpcruz@uefs.br

folhagem e por outros órgãos, entretanto, em termos funcionais, são utilizadas no paisagismo para o desempenho de várias funções que vão desde a divisão de espaços até a produção de flores e frutos para consumo humano (MENEZES, 2009).

O mercado de plantas ornamentais no Brasil é direcionado para o paisagismo e jardinagem de espécies já exploradas comercialmente, gerando ocupação, emprego e renda, o que movimenta a economia do país. FISCHER et al. (2007) mencionaram que quando se refere ao paisagismo no Brasil, por razões culturais, é priorizado o uso de plantas exóticas sobre as nativas. De acordo com LEAL e BIONDI (2006), mesmo apresentando um grande potencial ornamental, a flora nativa é praticamente ausente nos viveiros comerciais, sendo que algumas espécies correm o risco serem extintas antes mesmo de tornar seu potencial conhecido, enquanto as espécies exóticas e introduzidas são muito exploradas comercialmente.

Para suprir a necessidade desse mercado é importante estimular o uso de espécies nativas em projetos paisagísticos sustentáveis, cujo potencial é pouco valorizado. De acordo com BECKMANN-CAVALCANTE (2017), no Brasil, vários estudos com espécies nativas e endêmicas para uso no paisagismo têm mostrado resultados positivos que evidenciam perspectivas de novidades para a floricultura nacional, tornando uma boa alternativa para os produtores, devido às suas várias possibilidades econômicas.

De acordo com SOUSA (2016), dados sobre o potencial ornamental e uso de espécies nativas ainda são escassos, e por isso o reconhecimento de características ornamentais é um avanço para que as espécies sejam inseridas no mercado (HEIDEN et al., 2007; STUMPF, 2009).

Muitas famílias de plantas apresentam potencial ornamental, dentre elas Euphorbiaceae, constituída de 200 gêneros e 6.750 espécies, com distribuição cosmopolita, ocorrendo predominantemente nas regiões tropicais de todo o planeta (WEBSTER, 2014). No Brasil a família é representada por ca. 1000 espécies, que estão agrupadas em 64 gêneros (SILVA et al, 2020).

Segundo SOUZA e LORENZI (2019), as Euphorbiaceae apresentam diversas espécies de interesse econômico, como a seringueira (Hevea brasiliensis Willd. ex A. Juss.) Müll.Arg.) utilizada na produção de borracha; a mamona (Ricinus communis L.), com sementes ricas em óleo e diversas aplicações na indústria; e a mandioca (Manihot esculenta Crantz), usada na alimentação. Algumas espécies de Euphorbia L., Jatropha L., Codiaeum Rumph. ex A. Juss. e Acalypha L. são ornamentais, destacando-se o aspecto atrativo das folhagens e brácteas, segundo esses autores.

O gênero Jatropha contém aproximadamente 180 espécies, distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo (WEBSTER, 2014). As espécies já estudadas de Jatropha mostram-se fontes de moléculas interessantes do ponto de vista científico e farmacológico (HIROTA et al., 2010). Algumas espécies são utilizadas informalmente como ornamentais, além das introduzidas e já exploradas comercialmente, a exemplo de J. multifida L. e J. podagrica Hook.

No contexto apresentado, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de identificar espécies do gênero Jatropha que ocorrem no estado da Bahia, que apresentem características morfológicas apropriadas para uso no paisagismo, bem como disponibilizar as informações sobre suas características ornamentais.

Material e Métodos

Os materiais analisados foram provenientes do estudo das espécies de Jatropha no estado da Bahia, além dos materiais adquiridos através de expedições de campo realizadas no período de novembro de 2018 a dezembro de 2019, seguindo as técnicas convencionais de herborização segundo MORI et al. (1989).

Foi realizada a documentação fotográfica das espécies coletadas e anotações em caderneta de campo das características morfológicas e ecológicas dos espécimes, localização, altitude, luminosidade, tipo de solo, anotações de floração e frutificação. Posteriormente, todo material foi depositado na coleção do Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS). Informações gerais sobre cada espécie foram obtidas a partir de revisão bibliográfica e materiais depositados no HUEFS.

A avaliação das espécies foi realizada de acordo com as características consideradas essenciais (Tabela 1) segundo STUMPF (2009) para cultivo e uso, eliminando as preferências pessoais, para identificar as características ornamentais das espécies selecionadas (Tabela 2).

Tabela 1. Atributos utilizados para a avaliação das características ornamentais de plantas nativas com possibilidade de uso no paisagismo

Tabela 2. Características ornamentais das espécies de Jatropha do Estado da Bahia, com indicação de uso no paisagismo. NR: Não registrado

Para a indicação de uso, as plantas foram categorizadas em: 1. Plantas para jardins (indicadas para formação de maciços, cercas-vivas, bordaduras, forrações, ou para uso isolado); 2. Plantas para vasos, indicadas para o cultivo em recipientes de diferentes volumes; ou 3. Plantas multifuncionais indicadas tanto para jardins como para o cultivo em vasos (Tabela 2).

Outro aspecto analisado foi a associação das plantas para fins de uso paisagístico, segundo CORADIN (2016), as quais são divididas em: Isolado: a característica ornamental pode ser representada por diferentes partes da planta como flores, folhagens, frutos, troncos, galhos, entre outros. Maciços: o agrupamento de plantas da mesma espécie, ou de espécies diferentes, que dá volume ao espaço que será ocupado proporcionalmente tanto no sentido horizontal como no vertical. Bordadura: plantas de pequeno porte, que compõem as bordas de um canteiro, caminho ou até mesmo de uma árvore em destaque. Cerca-Viva: plantas de médio a grande porte, dispostas de forma que divide os ambientes.

Resultados e Discussão

De acordo com BIGIO (2022), as espécies do gênero Jatropha que ocorrem no estado da Bahia são: J. calcarea Fern. Casas, J. curcas L., J. elliptica (Pohl) Oken, J. gossypiifolia L., J. hastifolia Fern.Casas, J. longibracteata A.S. Moreira & Carn.-Torres sp. nov., J. martiusii (Pohl) Baill., J. mollissima (Pohl) Baill., J. mutabilis (Pohl) Baill. J. paganuccii A.S. Moreira & Carn.-Torres sp. nov., J. palmatipartita Dehgan e J. ribifolia (Pohl) Baill. A maioria das espécies analisadas é citada pela primeira vez aqui, quanto ao seu potencial ornamental.

Das 12 espécies analisadas, seis são endêmicas do estado da Bahia (J. calcarea, J. hastifolia, J. longibracteata, J. martiusii, J. paganuccii, J. palmatipartita). Algumas já possuem registro de uso, como a J. curcas (ALVES et al., 2008), J. gossypiifolia (CREPALDI, 2013), J. mollissima (BECKMANN-CAVALCANTE et al., 2017) e J. mutabilis (GALLINDO, 1985), porém essas espécies são pouco ou não são comercializadas.

Todas as espécies foram encontradas em habitats onde as temperaturas são elevadas e normalmente ficam expostas ao sol em áreas abertas, assim acredita-se que resistem a altas temperaturas e à escassez de água, características atrativas para fins paisagísticos, uma vez que não necessitam de rega diária. A maioria das espécies analisadas (11 spp.) possui hábito arbustivo podendo ser usadas em vasos, jardins, isoladas ou em composição com outras espécies. Apenas uma espécie (J. elliptica) apresenta hábito herbáceo também podendo ser utilizada em vaso, jardim ou isolada. Segundo LEAL e BIONDI (2006), plantas de porte herbáceo podem ser utilizadas como forração combinados ou não com outras espécies; bordaduras, delimitando caminhos e canteiros.

As cores das folhas das espécies variaram de verde claro a roxo, indicando um efeito policromático, porém a maioria apresenta uma variação de verde-claro a verde escuro, que indica um efeito monocromático (SOUSA, 2016). Quanto às cores das flores, oito espécies apresentam cores quentes e vistosas, variando de vináceo, vermelho, vermelho-alaranjado, amarelo com ápice vináceo, e quatro espécies apresentam cores neutras, como amarelo a amarelo-esverdeado (J. curcas, J. elliptica, J. longibracteata e J. ribifolia). Segundo SOUSA (2016) e de acordo com STAMATO et al. (2013) as cores quentes dão sensação de calor e luz.

A simetria das plantas é um fator importante na ornamentação. As plantas que possuem o aspecto simétrico, a tendência de crescimento é mais no sentido de alongamento e geralmente são ótimas para quem deseja alcançar um efeito vertical (BIONDI, 1990).

Assim, o conhecimento dessas variáveis estéticas é de grande importância para indicar a melhor utilização das espécies em projetos paisagísticos (LEAL; BIONDI, 2006), podendo ser empregadas de diversas formas. Caracterização das espécies

1. Jatropha calcarea Fern. Casas (Figura 1A-C) possui hábito arbustivo a arvoreta de médio porte, simétrico, podendo alcançar 3 m alt. Arquitetura equilibrada com caule descamante, cascas vistosas. As folhas são persistentes, brilhantes, lisas, pilosas, verdes, apresentando tricomas vermelhos na margem da folha. Apresenta inflorescência terminal com flores pequenas, rosa a vermelha, sem aroma, fruto deiscente e verde. Encontrada com floração nos meses de fevereiro, outubro e dezembro. A espécie é pouco conhecida, ocorrendo no oeste da Bahia em vegetação de caatinga sobre afloramento calcário. Pode ser usada em jardins, isolada ou em conjunto com outras espécies. Tem como características de destaque favorável para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, caule descamante e folhagem. Voucher: A.S. Moreira 77 (HUEFS).

2. Jatropha curcas L. (Figura 1D-F) é popularmente conhecida como pinhão-manso. É um arbusto de médio a grande porte, equilibrado e simétrico, podendo alcançar 3 m alt. As folhas são persistentes, opacas, lisas, glabras e verdes. Apresenta inflorescência terminal com flores delicadas, pequenas, verde-amareladas, sem aroma. Fruto deiscente e variando entre verde, amarelo e marrom. É muito cultivada no mundo todo, pois é utilizada na produção de biodiesel (PARAWIRA, 2010; FERREIRA et al., 2013). Pode ser encontrada com flores em janeiro, fevereiro, maio e julho, e frutos em fevereiro, março e outubro. Apresenta fácil propagação de suas sementes. Essa espécie tem como característica de destaque favorável para o uso como ornamental, seu hábito arbustivo, folhagem e frutos. Por ser uma planta robusta, pode ser usada como cerca viva, além de gerar áreas sombreadas. Voucher: A.S. Moreira 3 (HUEFS).

3. Jatropha elliptica (Pohl) Oken (Figura 1G-H) é popularmente conhecida como purga de lagarto, batata de tiú ou erva de tiú devido à presença de uma raiz tuberosa que é ingerida por espécies de Teiú (Tupinambis spp.), quando é atacado por cobras. É uma erva ou subarbusto de pequeno porte, equilibrado e simétrico, podendo alcançar 70 cm alt. As folhas são persistentes, opacas, lisas, pilosas e verdes. Apresenta inflorescência terminal com flores pequenas, amareladas com marcações vermelhas, sem aroma, fruto deiscente e verde. A floração pode ocorrer em abril, maio, junho, setembro, novembro e dezembro. A espécie é encontrada predominantemente em regiões de Cerrado. Tem como característica de destaque favorável para o uso como ornamental seu hábito herbáceo e flores delicadas. Pode ser usada em jardins, como forração combinados ou não com outras espécies; bordaduras, delimitando caminhos/canteiros ou até mesmo cultivo em vasos. Voucher: A.S. Moreira 70 (HUEFS).

4. Jatropha gossypiifolia L. (Figura 1I-K) popularmente conhecida como pinhão-roxo, devido à coloração de suas folhas e flores. É um subarbusto ou arbusto perene, de pequeno a médio porte, equilibrado e simétrico, podendo alcançar 3 m alt. As folhas são persistentes, brilhantes, lisas, glabras e variando do verde ao arroxeado. Apresenta inflorescência terminal, com flores singelas, pequenas, porém vistosas, devido à sua coloração intensa, arroxeadas, com estames amarelos e sem aroma. Fruto deiscente e verde. A floração pode ocorrer durante todo o ano, sendo esta espécie facilmente encontrada em terrenos e canteiros, devido a suas sementes se propagarem facilmente. Tem como características de destaque favoráveis para o uso como ornamental o hábito arbustivo, folhagem e flores com coloração chamativa. Essa espécie já é muito utilizada como ornamental na Região Nordeste. Pode ser usada em jardins ou até mesmo em vasos. Voucher: A.S. Moreira 2 (HUEFS).

5. Jatropha hastifolia Fern.Casas (Figura 2A-B) é um arbusto de pequeno a médio porte, horizontalizado, assimétrico e vistoso, podendo alcançar 2 m alt. As folhas são persistentes, brilhantes, pilosas e verdes. Apresenta inflorescência terminal, com flores vistosas e vermelho intenso brilhante, sem aroma. Fruto deiscente e verde. Por apresentar uma arquitetura assimétrica, horizontalizada, e apresentar floração/frutificação na maior parte do ano, é uma espécie que pode ser usada em jardins ou até como cerca-viva. Essa espécie tem como característica de destaque favorável para o uso como ornamental, o formato das folhas e flores vistosas. Voucher: A.S. Moreira 30 (HUEFS).

6. Jatropha longibracteata A.S. Moreira & Carn.-Torres (Figura 2C-F) é um arbusto de médio porte, verticalizado e assimétrico, podendo variar de 1,8 a 3 m alt. As folhas são grandes, vistosas opacas, lisas, glabras e verdes. Apresenta inflorescência terminal com muitas flores verde-amareladas e sem aroma. Fruto deiscente e verde. Pode ser encontrada na fase de floração e frutificação nos meses de janeiro, março e dezembro. Essa espécie tem como característica de destaque favorável para o uso como ornamental, seu hábito arbustivo, podendo ser usada em jardins isolada ou em associação com outras espécies. Voucher: A.S. Moreira 66 (HUEFS).

Figura 2. Jatropha hastifolia A. Flor pistilada; B. Forma das folhas. Jatropha longibracteata C. Hábito; D. Inflorescência com flor pistilada; E. Inflorescência com flor estaminada; F. Fruto; Jatropha martiusii G. Hábito; H. Forma da folha; I. Inflorescência com flor pistilada; Jatropha mollissima J. Forma da folha; K. Flores estaminadas; L. Fruto. Fotos: A.S. Moreira.

7. Jatropha martiusii (Pohl) Baill. (Figura 2G-I), é um arbusto de médio porte, verticalizado e simétrico, podendo variar de 1,5 a 4 m alt. As folhas são persistentes, grandes, vistosas opacas, lisa, glabras e verdes. Apresenta inflorescência terminal com muitas flores vistosas e corola amarela com ápice vináceo, brilhante, as flores sem aroma. Fruto deiscente e verde. Essa espécie tem como características de destaque favoráveis para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, folhagem e flores. Por apresentar arquitetura simétrica, verticalizada e floração e frutificação na maior parte do ano, pode ser usada em jardins. Voucher: A.S. Moreira 24 (HUEFS).

8. Jatropha mollissima (Pohl) Baill. (Figura 2J-L) popularmente conhecida como pinhão-branco. É um arbusto perene, médio porte, equilibrado e simétrico, com caule descamante, podendo alcançar 5 m alt. As folhas são persistentes, numerosas, pilosas e verdes. Apresenta inflorescência terminal, com flores vistosas, coloração podendo variar de amarela com ápice avermelhado a vermelho alaranjado, com estames amarelos, as flores sem aroma. Fruto deiscente, verde, grande e com projeções longitudinais. Pode ser encontrada com flores e frutos na maior parte do ano, podendo ser usada de diversas formas, em jardins ou cercas-vivas. Essa espécie tem como características de destaque favorável para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, caule descamante, folhagem e flores. Voucher: A.S. Moreira 17 (HUEFS).

9. Jatropha mutabilis (Pohl) Baill. (Figura 3A-C) popularmente conhecida como pinhão da “foia” miúda. É um arbusto de pequeno a médio porte, horizontalizado e assimétrico, podendo alcançar 3 m alt. As folhas são pequenas, arredondadas, numerosas, glabras ou pilosas e verde brilhantes. Apresenta inflorescência terminal, com flores vistosas, vermelho alaranjado e estames vistosos amarelos, as flores sem aroma com constante visitação de insetos (Figura 3A). Fruto grande, deiscente, verde e presença de projeções longitudinais. Por apresentar arquitetura assimétrica, horizontalizada, apresentar floração e frutificação praticamente o ano todo, é uma espécie que pode ser usada em jardins (cultivo isolado) ou até como cerca-viva. Essa espécie tem como características de destaque favorável para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, formato das folhas e flores. Voucher: A.S. Moreira 29 (HUEFS).

10. Jatropha paganuccii A.S. Moreira & Carn.-Torres (Figura 3D-G) é um arbusto perene, de médio porte, de forma equilibrada e simétrica, que pode alcançar 3 m alt. As folhas são persistentes, de tamanho médio, pilosas e verdes. Apresenta inflorescência terminal, suas flores são vistosas com coloração amarelo-esverdeado e no ápice atropurpúreo, sem aroma. Fruto deiscente e verde. Apresenta floração que pode ocorrer durante os meses de janeiro, fevereiro, abril, julho e dezembro. Essa espécie tem como características de destaque favorável para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, folhagem e flores. Voucher: A.S. Moreira 76 (HUEFS).

11. Jatropha palmatipartita B. Dehgan (Figura 3H-J) é um arbusto de médio porte, de forma equilibrada e simétrica, com cerca de 2 m alt. As folhas têm tamanho médio, glabras e verdes. Apresenta inflorescência terminal, suas flores possuem cor vermelha a purpúreo e sem aroma. Fruto deiscente e verde. Apresenta floração que pode ocorrer durante os meses de fevereiro, março, outubro, novembro e dezembro. Essa espécie pode ser utilizada em jardins ou até mesmo cultivada em vasos. Tem como características de destaque favorável para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, folhagem e flores. Voucher: L.Y.S. Aona 1647 (HUEFS).

12. Jatropha ribifolia (Pohl) Baill. (Figura 3K-L) é uma espécie popularmente conhecida como pinhãozinho ou pinhão miúdo. É um arbusto perene de pequeno porte, de forma equilibrada e simétrica, que pode alcançar 2 m alt. As folhas são persistentes, pequenas, pilosas e verdes. Apresenta inflorescência terminal, suas flores são delicadas, pequenas e de cor branco-amarelado, sem aroma. Fruto deiscente e verde. Apresenta uma arquitetura delicada, de pequeno porte, floração que pode ocorrer durante todo o ano, é uma espécie que pode ser usada em jardins ou até mesmo cultivada em vasos. Tem como características de destaque favorável para o uso ornamental, seu hábito arbustivo, folhagem e flores. Voucher: A.S. Moreira 27 (HUEFS).

Conclusão

Todas as espécies analisadas possuem características estéticas apropriadas, em consequência apresentam potencial para diferentes usos no paisagismo, o que estimula o uso de espécies nativas, cujo potencial ornamental ainda é pouco reconhecido e valorizado. No entanto, são necessários estudos mais específicos, buscando estabelecer protocolos de regeneração e estabelecimento das plantas.

A maior parte das espécies apresenta uso relacionado a jardins (ou cercas-vivas, ou outro uso) devido ao seu hábito arbustivo (compartilhado por 91,67% das espécies avaliadas). As características mais úteis e que conferem maior potencial ornamental às espécies de Jatropha são a arquitetura (hábito, forma e simetria), folhagem e flores. Além disso, flores vistosas e floração em boa parte do ano favorecem a utilização das espécies J. gossypiifolia, J. hastifolia, J. martiusii, J. mollissima, J. mutabilis e J. ribifolia

As espécies do gênero podem ser usadas em áreas com menor pluviosidade, as quais são nativas de áreas de Caatinga, ocorrentes em localidades de altas temperaturas e escassez de água, o que seriam características atrativas, uma vez que não necessitam de rega diária.

E ainda, o uso de espécies de Jatropha pode ocasionar uma pressão de exploração em populações de J. calcarea e J. paganuccii, consideradas sob ameaça de extinção, sendo mais relevantes a conservação in situ

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Conservação e domesticação de Hyptidinae (Lamiaceae): a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana

Resumo

Hyptidinae (Lamiaceae) é majoritariamente neotropical, com cerca de 400 espécies e 19 gêneros. Esta família botânica é bem estudada, em virtude do vasto uso na medicina popular. Estudos nas áreas de conservação e domesticação favorecem a preservação do germoplasma e utilização sustentável dessas espécies. O trabalho objetivou realizar um levantamento bibliográfico dos estudos com a subtribo Hyptidinae, nestas áreas, destacando a contribuição da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS). O levantamento ocorreu nas plataformas digitais SciELO, Plataforma de periódicos CAPES, Science Direct e Biblioteca Digital de Teses e Dissertações, utilizando palavras chaves relacionadas às áreas de estudo, considerando-se artigos publicados nos últimos 20 anos. Também foram levantados os registros no Herbário, teses e dissertações produzidas na UEFS. Identificou-se 121 artigos, em maioria envolvendo o gênero Hyptis. Foram realizados 4405 registros no herbário da instituição (HUEFS) e publicadas 17 dissertações e teses. Os dados indicam interesse crescente sobre espécies da subtribo Hyptidinae, o que decorre da grande importância econômica e etnofarmacológica das mesmas, cuja eficácia e segurança já foram comprovados para várias espécies.

Palavras-Chave: Hyptis; Recursos Genéticos Vegetais; plantas medicinais; germoplasma; cultivo.

Abstract

(Conservation and domestication of Hyptidinae (Lamiaceae): the contribution of the State University of Feira de Santana). Hyptidinae (Lamiaceae) is mostly neotropical, with about 400 species and 19 genus. This botanical family is well studied, due to its wide use in folk medicine. Studies in the areas of conservation and domestication favor the preservation of germplasm and the sustainable use of these species. The objective of this work was to carry out a bibliographic survey of studies with the Hyptidinae subtribe, in these areas, highlighting the contribution of the State University of Feira de Santana (UEFS). The survey took place on the digital platforms SciELO, CAPES Journal Platform, Science Direct and Digital Library of Theses and Dissertations, using keywords related to the areas of study, considering articles published in the last 20 years. Records at the Herbarium, theses and dissertations produced at UEFS were also surveyed. 121 articles were identified, most involving the Hyptis genus. 4405 records were made in the institution's herbarium (HUEFS) and 17 dissertations and theses were published. The data indicate a growing interest in species of the Hyptidinae subtribe, which stems from their great economic and ethnopharmacological importance, whose efficacy and safety have already been proven for several species.

Keywords: Hyptis; Plant Genetic Resources; medicinal plant; germplasm; cultivation.

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: mclaragro@gmail.com

2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: lenaldo.uefs@gmail.com

Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail:ianna_freitas@hotmail.com

Introdução

O Brasil, entre todos os países do mundo, é considerado o que detém a maior diversidade de espécies vegetais, com cerca de 35.500espécies de espermatófitas nativas, das quais mais de 50% são endêmicas do país (FLORA E FUNGA DO BRASIL, 2020). Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2022) o país abrange cerca de 8.515.759 quilômetros quadrados e uma diversidade de clima, solo e geomorfologia, que acabam compondo as variadas paisagens e biomas e contribuindo com a diversidade genética nos mesmos. Fazendo parte dessa biodiversidade há os Recursos Genéticos Vegetais (RGVs), que compreendem todo o material genético vegetal existente com potencial para usos, sejam atuais ou futuros, servindo de precursores para programas de melhoramento genético (SALOMÃO et al., 2019).

Em meio a esses recursos encontram-se as plantas medicinais e aromáticas que, por possuírem compostos bioativos, têm elevado potencial para utilização em indústrias de cosméticos, alimentos, fármacos, entre outros (DE SÁ FILHO et al., 2021). No entanto, apesar da grande importância, ainda são poucos os estudos direcionados à maioria das espécies medicinais, sendo estes concentrados em espécies que já estão inseridas no mercado comercial (ZAGO; MOURA, 2018). Desta forma, tendo em vista a grande importância e uso popular desses recursos para fins terapêuticos, a utilização destas plantas ocorre, em grande maioria, de forma extrativista, ou seja, o recurso genético é retirado da natureza sem um controle adequado e não há a sua reposição, sendo possível favorecer a erosão genética e o desaparecimento das espécies, colocando a biodiversidade em risco (COSTA et al., 2012).

Entre as espécies medicinais que têm sofrido com o extrativismo descontrolado, encontram-se as da família Lamiaceae, que têm elevado potencial medicinal e importância econômica, ocorrendo em grande parte do semiárido brasileiro (HARLEY et al., 2015). A família Lamiaceae abrange cerca de 300 gêneros e 7200 espécies (BEKUT et al., 2018). Para plantas dessa família botânica têm sido relatado diversas propriedades medicinais, abrangendo propriedades antimicrobianas, antiinflamatórias, antifúngicas, citotóxicas, anti-HIV, inseticida, analgésica, entre outros (MAMADALIEVA et al., 2017).

A subtribo Hyptidinae apresenta cerca de 400 espécies, que podem ser encontradas em diversos ambientes, principalmente na região neotropical (HARLEY; PASTORE, 2012). Essa subtribo passou por revisão taxonômica recente, por meio de marcadores moleculares, na qual apenas o gênero Hyptis foi considerado parafilético, enquanto todos os outros gêneros parecem ser derivados do mesmo ancestral. Com isso, elevou-se para 19 o número de gêneros incluídos na subtribo, sendo estes Eriope Bonpl. ex Benth, Asterohyptis Epling, Physominthe Harley & J.F.B.Pastore, Hypenia (Mart. ex Benth.) Harley, Eriopidion Harley, Marsypianthes Mart. ex Benth., Leptohyptis Harley & J.F.B.Pastore, Oocephalus (Benth.) Harley & J.F.B.Pastore, Hyptis Jacq., Eplingiella Harley & J.F.B.Pastore, Rhaphiodon Schauer, Cyanocephalus (Pohl & Benth.) Harley & J.F.B.Pastore, Medusantha Harley & J.F.B.Pastore, Martianthus Harley & J.F.B.Pastore, Condea Harley & J.F.B.Pastore, Gymneia (Benth.) Harley & J.F.B.Pastore, Cantinoa Harley & J.F.B.Pastore, Mesosphaerum P.Browne, Hyptidendron Harley (PASTORE et al., 2011; HARLEY; PASTORE, 2012; ANTAR; SANO, 2021).

Assim, considerando que as plantas medicinais, enquanto recursos genéticos vegetais é a matéria prima para novos medicamentos e demais usos (CASTRO; FIGUEREDO, 2019), tornam-se necessários programas de conservação e domesticação das espécies silvestres. Estudos nessa área favorecem o conhecimento sobre a diversidade e variabilidade genética, assim como a manutenção de parentes silvestres de espécies já domesticadas e a descoberta de novas utilidades e potenciais (COSTA et al., 2012).

Nesse contexto, é possível encontrar na literatura diversos trabalhos voltados para estas áreas, com gêneros da subtribo Hyptidinae, incluindo os realizados pela Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), que realiza desde 2003 estudos com espécies medicinais pertencentes a essa subtribo, envolvendo aspectos da conservação, caracterização de germoplasma, domesticação e atividade biológica.

O objetivo desse estudo foi realizar um levantamento bibliográfico dos estudos realizados com a subtribo Hyptidinae (Lamiaceae), na área de conservação e domesticação, com destaque para a contribuição da UEFS, a fim de auxiliar, como material base e de fácil acesso, estudos atuais e futuros.

Material e Métodos

Levantamento bibliográfico

O levantamento foi realizado através de consultas nas plataformas digitais Scientific Eletronic Library Online (SciELO) (https://scielo.org/), Plataforma de periódicos CAPES (https://www.periodicos.capes.gov.br/), ScienceDirect (https://www.sciencedirect.com/) e Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (https://bdtd.ibict.br/vufind/Content/whatIs).

Foram definidas as palavras chave: Hyptidinae, Conservation, Cultivation, Propagation, Morphology, Biomass, Agronomic, Growth, Ecogeografic, Characterization, Domestication Hyptis, Eriope, Asterohyptis, Physominthe, Hypenia, Eriopidion, Marsypianthes, Leptohyptis, Oocephalus, Eplingiella, Rhaphiodon, Cyanocephalus, Medusantha, Martianthus, Condea, Gymneia, Cantinoa, Mesosphaerum e Hyptidendron, de forma individualizada e cruzadas entre si. Seleção dos trabalhos e organização dos dados

Os trabalhos foram selecionados, com relação ao tema e ano, identificando os artigos publicados nos últimos 20 anos (entre 2002 e 2022). Adicionalmente, foi realizado o levantamento dos estudos já realizados pela UEFS com espécies da subtribo, sendo estes, artigos, dissertações de mestrados e teses de doutorado. Dados de registro de coleta do herbário da instituição (HUEFS) também foram levantados, de acordo com o acesso aos dados de entrada no herbário, através da plataforma speciesLink (https://specieslink.net/).

Os dados obtidos foram organizados e sistematizados com a confecção de gráficos e tabelas utilizando o Microsoft Excel.

Resultados e Discussão

O levantamento bibliográfico detectou 112 artigos científicos, publicados no período de 2002 e 2022, sendo 39 destes, nos últimos cinco anos. O gênero Hyptis foi o mais pesquisado (Gráfico 1), o que pode ser explicado, pois, a subtribo Hyptidinae, que era originalmente descrita com quatro gêneros, incluindo Hyptis, sofreu modificações genéricas, baseadas em análises morfológicas e moleculares, sendo reclassificada em 19 gêneros. Assim, diversas espécies que eram descritas como Hyptis passaram para outros táxons genéricos (PASTORE et al., 2011) embora, nessa nova classificação, o gênero Hyptis ainda seja o que contém a maior quantidade de espécies (HARLEY et al., 2015).

O gênero Hyptis é amplamente estudado, levando em consideração o seu potencial medicinal, antibacteriano, antioxidante, antiviral, citotóxico, entre outros (MARTÍNEZ-FRUCTUOSO et al., 2019; MAGALHÃES et al., 2020; MISHRA; SOHRAB; MISHRA, 2021; BONILLA-LANDA et al 2022).

A área de estudo “caracterização de germoplasma” foi à predominante, representando 55% das publicações (Gráfico 1). Estudos de caracterização são essenciais para os programas de conservação e melhoramento genético (COSTA et al., 2012), pois faz-se necessário conhecer o germoplasma e seus caracteres, para identificá-lo, preservá-lo e domesticá-lo (LIMA et al., 2018). Ademais, pela subtribo ter um alto potencial medicinal, a maior parte dos trabalhos de caracterização foi voltada para a composição química das espécies.

A Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) vem desenvolvendo pesquisas na área de recursos genéticos de plantas medicinais desde 2003, apresentando maior impulso a partir de 2007, com a criação do Programa de PósGraduação em Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV).

1. Quantidade de artigos publicados por gênero e por área de estudo, para as espécies da subtribo Hyptidinae (Lamiaceae), no período de 2002 a 2022.

Elaborado pelos autores

Com base no levantamento realizado no HUEFS foram constatados 4405 registros de espécies pertencentes aos gêneros da subtribo Hyptidinae (Gráfico 2), sendo 36,6% do gênero Hyptis. Apenas para o gênero Aterohyptis não foi identificado registro. A subtribo é composta por gêneros nativos no país, variando entre endêmicos e não endêmicos, com espécies distribuídas, majoritariamente, entre os biomas Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica (FLORA E FUNGA DO BRASIL, 2020).

O elevado grau de endemismo de muitas espécies da subtribo tem despertado o interesse crescente por estudos na área de conservação e domesticação. A ocorrência restrita dessas espécies as torna mais susceptíveis à perda de variabilidade e, consequentemente, risco de extinção. As espécies Eplingiella cuniloides (Epling) Harley & J.F.B.Pastore e Eplingiella brightoniae Harley, por exemplo, têm ocorrência limitada a campos rupestres do município de Morro do Chapéu, Bahia e solos rochosos localizados entre os municípios de Umburanas e Sento Sé, também na Bahia, respectivamente, ambas as espécies habitam locais sujeitos a queimadas freqüentes e mineração, apresentando elevado risco de extinção (HARLEY; PASTORE, 2012; HARLEY, 2014).

Gráfico 2. Quantidade de registros de coletas de genótipos da subtribo Hyptidinae (Lamiaceae), no HUEFS.

Fonte: Elaborado pelos autores

Entre as espécies registradas, 24 constam como ameaçadas, variando entre os seguintes níveis de perigo: Em perigo (EN); Criticamente em perigo (CR) e Vulnerável (VU) (Tabela 1). As espécies Eriope blanchetii (Benth.) Harley, Eriope luetzelburgii Harley, Hyptidendron leucophyllum (Benth.) Harley, Hyptis arenaria Benth, Hyptis frondosa S. Mooree Medusantha carvalhoi (Harley) Harley & J.F.B.Pastore, encontram-se em situação de vulnerabilidade. Segundo a União Internacional para a Conservação da Natureza e dos Recursos Naturais (IUCN, 2022), uma espécie está vulnerável quando a mesma se encontra em risco de extinção, sendo esta a sua condição, a não ser que a realidade seja modificada. A vulnerabilidade é causada, sobretudo, pela perda ou destruição de habitat. Espécies em perigo são aquelas que possivelmente serão extintas futuramente, sendo este o segundo estado mais alarmante. As espécies Cyanocephalus caprariifolius (Pohl ex Benth.) Harley & J.F.B.Pastore, Cyanocephalus tagetifolius (Harley) Harley & J.F.B.Pastore, Cyanocephalus viaticus (Harley) Harley & J.F.B.Pastore, Eriope anamariae Harley, Hypenia subrosea (Harley) Harley, Hyptidendron conspersum (Benth.) Harley, Hyptis alpestris A.St.-Hil. ex Benth., Hyptis bahiensis Harley, Hyptis colligata Epling & Játiva, Hyptis cruciformis Epling, Hyptis imbricatiformis Harley, Hyptis penaeoides Taub. ex Ule, Hyptis rhypidiophylla Briq. e Martianthus sancti-gabrielii (Harley) Harley & J.F.B.Pastoreestão categorizadas nesse nível. Por fim, as espécies Eriope cristalinae (Harley) Rizzini, Hypenia aristulata (Epling) Harley e Hyptidendron roseum Antar, Harley & J.F.B.Pastore, estão categorizadas como criticamente em perigo, sendo este o mais elevado grau de risco, tendo em vista que representa as espécies com grave risco de extinção.

Estes dados mostram a importância dos trabalhos de conservação, caracterização e domesticação de espécies, para fortalecer os programas de conservação de espécies medicinais nativas, principalmente para as que sofrem algum risco, tendo em vista que é imprescindível a conservação das espécies silvestres ou parentes já domesticados, visando a realização de pesquisas e identificação de potenciais usos atuais e futuros, além da sustentabilidade e preservação do germoplasma (COSTA et al. 2012; CARVALHO, 2019).

No período analisado, pesquisadores da UEFS publicaram nove artigos em revistas especializadas, sendo a maioria na área de cultivo, seguida por caracterização de germoplasma e domesticação (Tabela 2). Os estudos foram conduzidos com espécies de quatro gêneros: Hyptis, Eplingiella, Martianthus e Leptohyptis, sendo estes ocorrentes no semiárido (MEIRA et al., 2017; SANTOS BARROSO et al., 2018).

Tabela 1. Espécies da subtribo Hyptidinae ameaçadas registradas no HUEFS e o respectivo nível de perigo: em perigo (EN); criticamente em perigo (CR); vulnerável (VU).

Gênero Espécie Situação Cyanocephalus C.caprariifolius EN Cyanocephalus C.tagetifolius EN Cyanocephalus C.viaticus EN Eriope E.anamariae EN Eriope E.blanchetii VU Eriope E.cristalinae CR Eriope E.luetzelburgii VU Hypenia H.aristulata CR Hypenia H.subrosea EN Hyptidendron H. conspersum EN Hyptidendron H.leucophyllum VU Hyptidendron H.roseum CR Hyptis H. alpestris EN Hyptis H.arenaria VU Hyptis H.bahiensis EN Hyptis H.colligata EN Hyptis H.cruciformis EN Hyptis H.frondosa VU Hyptis H. imbricatiformis EN Hyptis H. penaeoides EN Hyptis H. rhypidiophylla EN Martianthus M. sancti-gabrielii EN Medusantha M. carvalhoi VU Oocephalus O.piranii EN Fonte: Elaborado pelos autores

Os quatro gêneros estudados têm potencial industrial, de acordo com pesquisas já realizadas. O gênero Hyptis, que foi predominantemente mais estudado, tem propriedades bioativas decorrentes da presença de monoterpenos, sesquiterpenos, ácido rosmarínico, favonoides e lignanas (SEDANO-PARTIDA et al., 2020). O gênero Eplingiella foi o segundo mais estudado, com propriedades antinociceptivas, antiinflamatórias e inseticida, devido à presença Ecariofileno, biciclogermacreno e α-pineno, podendo ser usado como formicida (SILVA et al., 2019), larvicida (SILVA et al., 2008), analgésico, antiinflamatório (BLANK et al., 2019), entre outros. Leptohyptis apresenta atividade espamolítica e antidiarreica (IARA et al., 2013; SOUZA et al., 2020). Já o gênero Martianthus tem propriedades antinociceptivas e antiinflamatória (GOÉS et al., 2015).

A espécie mais estudada foi Martianthus leucocephalus (Mart. ex Benth.) J.F.B.Pastore, anteriormente designada Hyptis leucocephala Mart. ex Benth. A espécie é nativa e endêmica do Brasil, ocorrendo predominantemente no Nordeste do país, em regiões de Caatinga, Cerrado e Campo de Várzea (SOARES, 2020). Estudos conduzidos têm demonstrado o elevado potencial para o cultivo e exploração sustentável de Martianthus leucocephalus. AZEVEDO et al. (2015) avaliaram o crescimento e a produção de óleo da espécie e identificaram que a espécie pode ser cultivada em condições irrigadas, com capacidade de produção de óleo essencial durante todo o ano, com picos de produção entre os meses de março e setembro. Além disso, identificaram que as condições edáficas e climáticas influenciam nos teores de óleo e de massa seca da espécie, sendo esta influência positiva no período de verão austral. JESUS et al. (2016) buscando determinar o efeito de Cádmium, Cobre e Zinco na produção de óleo e no crescimento da planta, em cultivo hidropô-

nico, com a mesma espécie, identificaram que os metais afetaram negativamente o crescimento, porém a produção de compostos voláteis aumentaram com a presença de Zinco, mostrando que os compostos voláteis estão presentes em situação de estresse, o que sugere a possibilidade de cultivo da espécie em áreas poluídas com metais pesados.

Tabela 2. Artigos publicados por pesquisadores da Universidade Estadual de Feira de Santana com espécies da subtribo Hyptidinae, no período de 2002 a 2022. Título Ano Área de estudo Revista Referência Link

Propagação vegetativa de Hyptis leucocephala Mart. ex Benth. e Hyptis platanifolia Mart. ex Benth. (Lamiaceae) 2011 Cultivo

Induction and morphological and biochemical characterization of Hyptis leucocephala (Lamiaceae) calluses 2012 Caracterização de Germoplasma

Revista Brasileira de Plantas Medicinais

SITIENTIBUS série Ciências Biológicas

Germinação in vitro de Hyptis leucocephala Mart. ex Benth. e Hyptis platanifolia Mart. ex Benth 2014 Cultivo Revista Brasileira de Plantas Medicinais

OLIVEIRA et al. (2011)

PEREIRA et al (2012).

NEPOMUCENO et al. (2014)

Crescimento e produção de óleo essencial de Martianthus leucocephalus cultivada nas condições edafoclimáticas de Feira de Santana, Bahia, Brasil 2016 Cultivo Ciência Rural AZEVEDO et al (2016)

Growth and volatile compounds of Martianthus leucocephalus exposed to heavy metal stress 2016 Cultivo Ciência Rural JESUS et al. (2016)

Abiotic factors influencing podophyllotoxin and yatein overproduction in Leptohyptis macrostachys cultivated in vitro 2017 Cultivo Phytochemistry Letters MEIRA et al. (2017)

https://doi.org/ 10.1590/S151 605722011000 100011

https://doi.org/ 10.13102/scb1 24

https://doi.org/ 10.1590/1983084X/12_093

https://doi.org/ 10.1590/01038478cr201501 49

https://doi.org/ 10.1590/01038478cr201505 76

http://dx.doi.o rg/10.1016/j.p hytol.2017.10. 016

Composição de substrato e ácido indolbutírico na estaquia de "alecrim de vaqueiro" 2017 Cultivo Ciência Rural

Morphometric characterization of the seeds and germination of the species endemic in northeastern brazil: Subtribe-hyptidinae – lamiaceae 2018 Caracterização de Germoplasma

Ecogeographic studies on Eplingiella fruticosa (Salzm. Ex Benth. Harley& J.F.B.Pastore: A medicinal species of the semiarid region of Brazil

2021 Domesticação

BRAZILIAN JOURNAL OF AGRICULTURE

Research, Society and Development

Fonte: Elaborado pelos autores

SILVA; OLIVEIRA; SILVA (2017)

DOS SANTOS BARROSO et al. (2018).

DE OLIVEIRA et al. (2021)

https://doi.org/ 10.1590/01038478cr201502 33

https://doi.org/ 10.37856/bja. v93i1.3265

https://doi.org/ 10.33448/rsdv10i4.13963

No período analisado, pesquisadores da UEFS orientaram diversos trabalhos de mestrado e doutorado envolvendo espécies da subtribo Hyptidinae (Tabela 3 e 4), vinculados à diversos Programa de Pós-Graduação existentes na institui-

ção, como o Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais (PPGRGV), Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (PPGBiotec) e o Programa de Pós-Graduação em Botânica (PPGBOT). Foram concluídas nove dissertações de mestrado e sete teses de doutorado. A área de estudo mais ocorrente foi cultivo, com 27%, sendo seguido por atividade biológica (26%), caracterização de germoplasma (21%) e conservação (16%). Esses estudos abrangeram nove gêneros, sendo Eplingiella e Eplingiella fruticosa o gênero e a espécie mais estudados, respectivamente.

Eplingiella fruticosa é uma espécie de hábito arbustivo, caule esbranquiçado, folhas verdes e inflorescência azulvioleta e endêmica do Brasil, com ocorrência predominante no nordeste do país, principalmente nos biomas Caatinga e Mata Atlântica (SILVA et al., 2015; HARLEY, 2020). Os estudos conduzidos na instituição têm contribuído para a inserção dessa espécie em sistemas de cultivo e exploração de forma sustentável. SILVA et al. (2015), caracterizando doze genótipos da espécie Eplingiella fruticosa, quanto a aspectos morfológicos, fitoquímicos e moleculares, concluíram que há diferença genética entre genótipos, identificando aqueles com potenciais usos para estudos de melhoramento da espécie, que envolvam hibridação, com vistas à exploração da heterose, visando a obtenção de bons materiais para produção de biomassa foliar e, consequentemente, maior rendimento de óleo essencial. SANTOS et al. (2016), avaliando o potencial antimicrobiano da espécie, identificaram os compostos 1,8-cineol, E-cariofileno, α-humuleno, biciclogermacreno, espatulenol, óxido de cariofileno e α-cadinol como compostos majoritários.

Identificaram ainda o potencial antimicrobiano do óleo essencial da espécie contra Xanthomonas campestris pv. viticola e Ralstonia solanacearum, e antifúngico para os agentes que causam a podridão na pós-colheita de uva. Já OLIVEIRA et al. (2021) realizaram estudos ecogeográficos e de cultivo com a espécie e verificaram que os acessos estudados possuem aptidão para variados fatores ecogeográficos, o que favorece sua adaptação aos diferentes ecossistemas, com preferência para solos arenosos, ácidos, pouco férteis e com alta saturação de alumínio.

Tabela 3. Dissertações orientadas por pesquisadores da Universidade Estadual de Feira de Santana com espécies da subtribo Hyptidinae, no período de 2002 a 2022.

Titulo Área de Estudo Programa Ano Avaliação toxicológica, antinociceptiva, antiinflamatória e sobre o sistema nervoso central de Martianthus leucocephalus (Mart. ex Benth.) J.F.B.Pastore

Atividade Biológica PPGRGV 2013

Alterações fisiológicas e metabólicas em Hyptis fruticosa Salzm. ex. Benth e Ocimum gratissimum L. sob diferentes regimes hídricos Cultivo PPGRGV 2014 Crescimento, produção e composição química do óleo essencial de Martianthus leucocephalus (Mart. ex Benth.) J.F.B.Pastore em condições de Feira de Santana, Bahia, Brasil

Caracterização de germoplasma e Cultivo PPGRGV 2014

Micropropagação de Hyptis ramosa Pohl ex Benth. (Lamiaceae) Cultivo PPGRGV 2015

Avaliação do potencial antimicrobiano de Eplingiella fruticosa, Gymneia platanifolia e Medusantha martiusii (Lamiaceae) contra micro-organismos de interesse agrícola

Atividade Biológica PPGRGV 2016

Conservação in vitro de Hyptis ramosa Pohl ex Benth. (Lamiaceae) Conservação PPGRGV 2017

Estabelecimento e multiplicação in vitro de Eriope blanchetii (Benth.) Harley para quantificação da produção de podofilotoxina

Estudos ecogeográficos e domesticação de Eplingiella fruticosa (Salzm. ex Benth) Harley & J.F.B.Pastore

Atividade antinociceptiva de Oocephalus nubicola e Leptohyptis macrostachys

Fonte: Elaborado pelos autores

Cultivo PPGRGV 2019

Domesticação PPGRGV 2020

Atividade Biológica PPGBIOTEC 2014

Tabela 4. Teses orientadas por pesquisadores da Universidade Estadual de Feira de Santana com espécies da subtribo Hyptidinae, no período de 2002 a 2022.

Titulo Área de Estudo Programa Ano

Caracterização agronômica, molecular e fitoquímica de Eplingiella Harley & J.F.B.Pastore

Conservação de sementes de espécies da subtribo Hyptidinae (Lamiaceae) nativas do semiárido baiano

Estresse de metais na produtividade de compostos oriundos do metabolismo secundário de Martianthus leucocephalus (Mart. Ex Benth.) J.F.B.Pastore

Atividade antimicrobiana de extratos de plantas pertencentes ao gênero Hyptis Jacq. coletadas no semi-árido baiano

Efeito do extrato das folhas de Eplingiella fruticosa na indução da proliferação e morte celular em indivíduos com infecção periodontal e sua atividade antimicrobiana

Filogenia Molecular da Subtribo Hyptidinae Endl. (Labiatae) e suas implicações taxonômicas

Propagação e conservação in vitro de Martianthus leucocephalus (Mart. ex Benth.) J.F.B.Pastore

Caracterização de germoplasma PPGRGV 2015

Conservação PPGRGV 2016

Cultivo e Caracterização de Germoplasma PPGRGV 2016

Atividade Biológica PPGBIOTEC 2008

Atividade Biológica PPGBIOTEC 2021

Filogenia PPGBOT 2010

Cultivo e Conservação PPGBOT 2012

Fonte: Elaborado pelos autores

As pesquisas realizadas com espécies da subtribo Hyptidinae refletem o interesse crescente por seus representantes. A produção de metabólitos secundários com interesse industrial, sobretudo óleos voláteis, presentes nos tricomas das folhas dessas espécies, justificam esse interesse, pois estes podem vir a ser fonte de matéria prima para a indústria farmacêutica, de cosméticos e alimentos, o que confere a essas plantas, grande potencial para exploração econômica.

Conclusão

O elevado número de táxons ameaçados, aliado ao potencial farmacológico, justifica o crescente interesse da pesquisa com espécies da subtribo Hyptidinae. A predominância das pesquisas nas áreas de caracterização e cultivo aponta para um processo de domesticação crescente, o que poderá criar condições para a exploração sustentável desses recursos.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Universidade Estadual de Feira de Santana, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro às pesquisas realizadas.

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Triagem fitoquímica de Myracrodruon urundeuva Fr. All sob diferentes cultivos

Resumo

Myracrodruon urundeuva Fr. All. é uma árvore popularmente conhecida como aroeira-preta ou aroeira-do-sertão, bastante utilizada na medicina popular. Este trabalho objetivou avaliar qualitativamente a composição química de diferentes órgãos de M. urundeuva submetidos a distintas condições de cultivo. Foram utilizados extratos metanólicos obtidos a partir de brotos, folhas, caule, raízes de plantas cultivadas em condições de campo e germinadas in vitro, além de cascas e folhas coletadas em ambiente natural. Os testes foram realizados para as classes de metabólitos de taninos, cumarinas, alcaloides, terpenos, flavonoides, esteroides e triterpenoides utilizando reagentes específicos para cada classe metabólica através de reações colorimétricas e de precipitação. Foram observadas taxas de rendimento que variaram entre 17,94 a 46,04% nos extratos analisados. A triagem fitoquímica dos extratos obtidos através dos diferentes cultivos possibilitou detectar a presença de uma variedade de metabólitos secundários. O tipo de cultivo altera o rendimento de extratos, mas não influencia o perfil fitoquímico das plantas de M. urundeuva, entretanto, existem diferenças na produção de metabólitos entre os distintos órgãos da espécie estudada.

Palavras-Chave: lenhosa medicinal; cultivo in vitro; metabolismo secundário; aroeira-do-sertão; brotações.

Abstract

(Phytochemical screening of Myracrodruon urundeuva Fr. All under different cultivation). Myracrodruon urundeuva Fr. All. is a tree popularly known as aroeira-preta or aroeira-do-sertão, widely used in folk medicine. This work aimed to qualitatively evaluate the chemical composition of different organs of M. urundeuva submitted to different cultivation conditions. We used methanolic extracts obtained from shoots, leaves, stem and roots of plants cultivated in field conditions and germinated in vitro, as well as bark and leaves collected in the wild. Tests were performed for the metabolite classes of tannins, saponins, alkaloids, terpenes, flavonoids, steroids, and triterpenoids using specific reagents for each metabolite class and observed colorimetric and precipitation reactions. Yield rates ranging from 17.94 to 46.04% were observed in the extracts analyzed. The phytochemical screening of the extracts obtained through the different cultivations made it possible to detect the presence of a variety of secondary metabolites. The type of culture alters the yield of extracts but does not influence the phytochemical profile of M. urundeuva plants; however, there are differences in the production of metabolites among the different organs of the studied species.

Keywords: medicinal woody; in vitro culture; secondary metabolism; aroeira-do-sertão; shoots.

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, Novo Horizonte, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil.E-mail: silva.stecla@gmail.com

Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, Novo Horizonte, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil.E-mail: eagronomocarvalho@gmail.com

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, Novo Horizonte, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil.E-mail: raica_ba@hotmail.com

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Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, Novo Horizonte, CEP 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil.E-mail: jose.raniere@gmail.com

Introdução

O uso da natureza para fins terapêuticos é tão antigo quanto a própria civilização humana, e por um longo período, os produtos naturais oriundos de minerais, plantas e animais foram fundamentais para a área da saúde no tratamento e na prevenção de diversas doenças (BRASIL, 2012).

O Brasil detém a maior diversidade biológica do mundo, contando com uma rica flora, que desperta interesses de comunidades científicas internacionais para o estudo, conservação e utilização racional destes recursos (SIMÕES, 2017).

Os vegetais produzem grande variedade de compostos orgânicos que parecem não possuir função direta no seu crescimento e desenvolvimento, tais substâncias são conhecidas como metabólitos secundários, metabolitos especiais, produtos secundários, produtos naturais (TAIZ; ZEIGER, 2017) ou metabólitos especiais. FUMAGALI et al. (2008) afirmam que os metabólitos secundários aumentam a probabilidade de sobrevivência de uma espécie, pois são responsáveis por diversas atividades biológicas como por exemplo, a proteção contra patógenos, no qual podem atuar como antibacterianos, antifúngicos e antivirais, agindo também como antigerminativas ou tóxicas para outras plantas através da síntese de fitoalexinas. Esses metabólitos em grande parte conferem ação medicinal às plantas que os produzem (CZELUSNIAK et al., 2012).

Sabe-se que as três principais classes de metabólitos secundários são os terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (TAIZ; ZEIGER, 2017). Os terpenos podem ser classificados em monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos entre outros, sendo que dentre os derivados dos triterpenos, tem-se os esteroides (TAIZ; ZEIGER, 2017). Os esteroides/triterpenoides possuem atividade anti-inflamatória (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010), ao passo que existem evidências de que alguns fitoesteroides são eficazes contra doenças cardiovasculares, reduzindo os níveis de colesterol sendo, por tanto, considerados alimentos funcionais e usados atualmente em alguns alimentos industrializados (QUEIROZ, 2009).

Os compostos fenólicos estão entre os principais antioxidantes presentes nas plantas (SILVA et al., 2010), dos quais fazem parte, dentre outros, as cumarinas, flavonoides e taninos. As cumarinas apresentam ação biológica no combate às enfermidades do trato respiratório, devido às ações broncodilatadora, expectorante, anti-inflamatória e antialérgica, comprovadas pelos diversos estudos realizados (CZELUSNIAK et al., 2012). Os flavonoides apresentam atividades anti-inflamatória, antialérgica, anticancerígena; enquanto os taninos ajudam no tratamento da hipertensão arterial, queimaduras, bactericida e fungicida (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010).

Como um dos representantes dos compostos nitrogenados, os alcaloides constituem uma grande família com mais de 15.000 metabólitos secundários encontrados em aproximadamente 20% das espécies vegetais vasculares, sendo que, entre os alcaloides farmacologicamente úteis tem-se a morfina (analgésico), a codeína e a escopolamina (TAIZ; ZEIGER, 2017), além de apresentarem ação antitumoral, antitussígeno e antiviral (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010).

As plantas medicinais, são assim chamadas, por apresentarem propriedades curativas e/ou preventivas para determinadas doenças devido à presença desses compostos bioativos. Assim, a fitoterapia qualifica-se como uma terapêutica caracterizada pelo uso de plantas medicinais nas diferentes formas farmacêuticas (CZELUSNIAK et al., 2012), representando fator de grande importância para a manutenção das condições de saúde humana. Além da comprovação da ação terapêutica de várias plantas utilizadas popularmente, a fitoterapia representa parte importante da cultura de um povo, sendo também elemento de um saber utilizado e difundido pelas populações ao longo de várias gerações. Essa prática popular vem contribuindo para pesquisas científicas e divulgação de propriedades terapêuticas, validando ou não o uso de determinadas plantas medicinais (TOMAZZONI et al., 2006).

A cultura de tecidos vegetais tem sido assinalada como valioso instrumento para o estudo dos metabólitos primários e secundários, constituindo um sistema apropriado para a produção de compostos farmacológicos importantes (MORAIS et al., 2012). Essa ferramenta biotecnológica permite a produção de metabólitos secundários in vitro,

assegurando assim, formas alternativas para a exploração sustentável de algumas espécies, principalmente em ecossistemas ameaçados (MORAIS et al., 2012).

A síntese e a quantidade dos compostos secundários nas plantas podem ser diferentes no cultivo in vitro quando comparados ao cultivo in vivo (KIRAKOSYAN et al., 2000), visto o controle das condições físicas e químicas possíveis nas condições in vitro. Dessa maneira, as análises fitoquímicas fornecem informações relevantes sobre a presença de metabólitos secundários nas plantas, para que assim possa-se chegar ao isolamento de princípios ativos importantes na produção de novos fitoterápicos (SILVA; MIRANDA; CONCEIÇÃO, 2010), sendo a triagem fitoquímica um procedimento importante para bioprospecção das espécies vegetais utilizadas na medicina tradicional de interesse farmacológico e/ou toxicológico (BESSA et al., 2013).

Dentre as espécies de utilização medicinal popular tem-se a Myracrodruon urundeuva Fr. All. (Anacardiaceae), de ampla distribuição na América do Sul, encontrada nas regiões Nordeste, Sudeste e Centro-Oeste. Árvore nativa Brasileira popularmente conhecida como aroeira-preta ou aroeira-do-sertão (LIMA, 2011), empregada no tratamento de hemorragias, infecções respiratórias, urinárias e distúrbios do sistema digestório (MONTEIRO et al., 2006), gastroprotetor, antiulcera (CARLINI et al., 2010). Sua entrecasca possui propriedades anti-inflamatórias (AQUINO, 2019) adstringentes, antialérgicas e cicatrizantes (VIANA et al., 1995); suas raízes são utilizadas no tratamento de reumatismo e suas folhas apresentam propriedades anti-helmíntica, inseticida e atividade larvicida (NAPOLEAO et al., 2012) e seus óleos essenciais apresentam propriedades antimicrobiana frente as bactérias Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa e Salmonella Enteritidis (ARAUJO et al., 2017).

Diante do exposto, esse trabalho objetivou avaliar qualitativamente a composição química de diferentes órgãos da M. urundeuva submetidas a distintas condições de cultivo.

Material e Métodos

Os ensaios foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais (LCTV), no Laboratório de Extração (LAEX), em casa de vegetação, localizados na Unidade Experimental Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), e no Laboratório de Bioprospecção Vegetal (LABIV) situado no campus da UEFS.

Material vegetal

Material cultivado em casa de vegetação

Sementes de M. urundeuva (após remoção do endocarpo dos frutos-sementes com fricções em peneira) foram colocadas em copos plásticos (500 mL) contendo terra vegetal, e mantidas em casa-de-vegetação com luminosidade de 70%. Após 60 dias, as folhas, o caule e as raízes foram excisadas para preparação dos extratos.

Material cultivado in vitro

Germinação em tubos de ensaio e em frascos (co-cultivo)

Sementes foram desinfestadas de acordo com a metodologia descrita por SILVA et al. (2020) e inoculadas em tubos de ensaio (25 x 150 mm) e em frascos (500 mL) contendo 10 e 70 mL de meio de cultura WPM (Woody Plant Medium) (LLOYD; McCOWN, 1980), respectivamente. Apenas uma semente foi colocada, por tubo de ensaio, e dez sementes em cada frasco (condição de co-cultivo). Após 60 dias, as folhas, o caule e as raízes foram excisadas para obtenção dos extratos vegetais.

Brotos induzidos in vitro

Foram utilizadas brotações obtidas a partir de segmentos nodais de plantas germinadas in vitro, induzidas em meio de cultura WPM com a utilização de 8,0 µM de BAP combinada com 10,0 µM de AgNO3 e suplementada com 1 g de PVP (polivinilpirrolidona). Após 45 dias, a parte aérea foi excisada para preparação do extrato. O meio de cultura em todos os tipos de cultivos in vitro foi suplementado com 87,64 mM de sacarose e solidificado com 7 g. L-1 de ágar.

Material in situ

Folhas e cascas coletadas de indivíduos adultos localizados no município de Petrolina-PE (Longitude: 367622º, Latitude: 9053666º e Altitude: 409 m) foram utilizadas para preparação dos extratos.

Preparo do material

Todo material coletado foi submetido à secagem em estufa de circulação de ar, a temperatura de 40°C, até obter peso constante, posteriormente de forma manual foi triturado utilizando almofariz e pistilo de porcelana. O material pulverizado foi pesado em balança semi-analítica para posterior cálculo de rendimento, obtido através da equação (RODRIGUES et al., 2011):

Rendimento (%) = Peso do extrato bruto x 100 Peso da massa seca vegetal

Preparo do extrato

O extrato bruto foi obtido através da técnica de maceração utilizando metanol como solvente extrator em temperatura ambiente, a partir do qual foram realizadas três extrações consecutivas. A cada extração, houve agitação ocasional e renovação do líquido extrator, através da filtragem em papel filtro e funil de vidro, em um intervalo de 72 horas. Em seguida, a solução obtida foi concentrada eliminando todo o solvente, originando o extrato bruto metanólico. Foram calculados o teor de rendimento de todos os extratos metanólicos de M. urundeuva obtido através de diferentes sistemas de cultivo: folhas, caules e raízes oriundas de plantas cultivadas em condições de casa de vegetação (folha campo, caule campo e raiz campo, respectivamente); folhas, caules e raízes oriundas de plantas cultivadas in vitro em tubos de ensaio (folha tubo, caule tubo e raiz tubo, respectivamente); folhas, caules e raízes oriundas de plantas cultivadas in vitro em frascos sob condições de co-cultivo (folha co-cultivo, caule co-cultivo e raiz co-cultivo, respectivamente); brotos induzidos in vitro via organogênese direta (brotos) e cascas e folhas coletadas em ambiente natural de ocorrência (casca in situ e folha in situ, respectivamente).

Triagem fitoquímica

A triagem fitoquímica foi realizada pela metodologia da prospecção preliminar e pela Cromatografia em Camada Delgada (CCD) a partir dos extratos metanólicos obtidos.

Cromatografia de camada delgada (CCD)

Os testes foram realizados seguindo a metodologia descrita por Vogel (1989) e Chaves (1997) apud Silva, Miranda e Conceição (2010) através de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) para todos os extratos com exceção daqueles oriundos da casca e das folhas coletadas em ambiente natural (casca in situ e folha in situ) devido ao rendimento da massa para realização dos testes.

A presença ou ausência dos grupos de metabólitos secundários e de alguns constituintes da espécie estudada foi verificada a partir da observação da reação característica esperada ou não, indicando a presença de resultado positivo ou negativo para cada grupo e constituinte analisado.

Preparação de placas

Para cromatografia em camada delgada, as placas foram preparadas utilizando aproximadamente 6g de sílica gel (sílica gel Kieselgel 60 PF254) e adicionados 14,5 mL de água destilada à sílica, sendo homogeneizada a suspensão com auxílio de bastão de vidro, posteriormente, espalhou-se uniformemente, sobre lâminas de vidro e então, foram levadas para serem ativadas em estufa a 60°C durante 30 minutos, estando em seguida prontas para uso.

Aplicação da amostra para análise

As amostras foram solubilizadas em metanol. A aplicação da amostra na placa foi feita com o auxílio de um tubo capilar. Tocou-se a extremidade na superfície de fase estacionária e o líquido foi transferido por capilaridade para a superfície da placa, penetrando-a.

Desenvolvimento e visualização da placa

Para o desenvolvimento da placa utilizou-se metodologia descrita por SILVA, MIRANDA e CONCEIÇÃO (2010) com adaptações. Inicialmente testou-se diferentes sistemas para melhor separação das substâncias nas placas contendo sílica gel. A fase móvel que apresentou melhor resolução cromatográfica foi a mistura de solventes clorofórmio/metanol (9:1). Os cromatogramas foram obtidos por uma técnica de ascensão, na qual a placa foi imersa até uma profundidade em torno de 0,5 cm no solvente de desenvolvimento em cuba cromatográfica. Em seguida foram retiradas e colocadas em luz ultravioleta (UV) através da câmera de UV (254 e 365 nm) para visualização e então foram aplicados os reveladores adequados com o auxílio de frasco borrifador.

Os reveladores utilizados foram específicos para cada classe de metabólitos pesquisados. Para taninos, borrifou-se a placa com solução de cloreto férrico 3%; para a identificação de alcaloides utilizou-se o reagente de Dragendorff como revelador; para as cumarinas utilizou-se o hidróxido de potássio (KOH) 10% e para esteroides/triterpenoides, usou-se o reagente de Liebermann-Burchard (MATOS, 2009).

Prospecção preliminar

Os testes qualitativos foram utilizados para detecção das principais classes de metabólitos secundários tais como taninos, flavonoides, cumarinas, triterpenos/esteroides e alcaloides seguindo a metodologia descrita por MATOS (2009) através de reações colorimétricas e/ou formação de precipitados, utilizando reagentes específicos para cada classe química. Os testes de prospecção preliminar foram aplicados para os extratos oriundos de casca e folha in situ para detecção de todas as classes de compostos químicos investigadas, e para os demais extratos essa técnica foi aplicada para a investigação de flavonoides.

A presença ou ausência dos grupos de metabólitos secundários de M. urundeuva foi verificada a partir da observação da reação característica esperada ou não, indicando a presença de resultado positivo ou negativo para cada grupo e constituinte analisado:

a) Fenólicos/taninos: Reação com cloreto férrico a 2% (FeCl3), acetato de chumbo (10%) e acetato de cobre (3%).

Os extratos (0,1g) foram solubilizados em 2 ml de água destilada, posteriormente filtrados e distribuídos em tubos de ensaios. Em cada tubo de ensaio contendo 2 ml da solução aquosa de cada extrato, foi adicionado 3 gotas de solução de FeCl3 a 2%, acetato de chumbo a 10% e acetato de cobre a 3%. Cada reação foi analisada separadamente utilizando os extratos dos órgãos da espécie. A presença de compostos taninos é identificada pela mudança de coloração do verde a marrom ou aparecimento de precipitado.

b) Flavonoides: Reação de Shinoda [fragmentos de magnésio e ácido clorídrico (HCl) concentrado] e hidróxidos alcalinos [hidróxido de sódio (NaOH)].

0,1 g dos extratos foram solubilizados em 10 mL de álcool 70% e aquecidos em banho-maria durante 15 minutos. Após serem filtrados, os extratos foram transferidos para tubos de ensaio para a realização da reação de Shinoda e com hidróxidos alcalinos.

Para reação de Shinoda, foi adicionado 3 mL de cada extrato em dois tubos. No primeiro tubo foram colocados alguns fragmentos de magnésio e acrescentou-se lentamente 1 mL de HCl concentrado, fazendo-se comparações da coloração obtida com o extrato contido no segundo tubo. A reação é positiva, indicando a presença de flavonoides, quando ocorre o aparecimento de coloração variando de rósea a vermelha do tubo 1.

Para reação com hidróxidos alcalinos, foram adicionados 2 mL de cada extrato em dois tubos de ensaio e adicionado 0,5 mL de solução de NaOH 1N em um dos tubos (tubo 1). Foram realizadas comparações da coloração obtida com o extrato contido no tubo sem reagente (tubo 2). A reação é positiva, indicando a presença de flavonoides, quando ocorre a intensificação da coloração amarelada no tubo 1.

A reação com NaOH não foi realizada para o extrato oriundo do caule cultivado em tubo de ensaio (caule tubo) por não ter massa suficiente para realização do teste.

c) Esteroides e triterpenoides: Reação de Lieberman- Burchard (anidrido acético com ácido sulfúrico concentrado).

Os extratos (0,1 g) foram solubilizados em 2 mL de clorofórmio e então filtrados com auxílio de funil fechado com algodão coberto com sulfato de sódio anidro (Na2SO4) e passada para um tubo de ensaio. Em seguida, foi adicionado 1 mL de anidrido acético e 3 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado, agitando-se suavemente.

O aparecimento da coloração azul seguida de verde permanente é indicativo da presença de esteroides livres, enquanto o aparecimento da coloração entre parda a vermelha indica a presença de triterpenoides livres.

d) Cumarinas:

Dissolveu-se 0,1 dos extratos em éter etílico PA (98%) e a partir desse extrato etanólico pingou-se uma gota em dois locais em um pedaço de papel filtro não fluorescente, e em seguida, aplicou-se uma gota de NaOH 10% sobre uma mancha. Os mesmos foram colocados em uma câmara com incidência de luz UV utilizando câmera de UV (254 e 365 nm) por cerca de 2 minutos e observados se houve o aparecimento de uma mancha fluorescente. O desenvolvimento de fluorescência azulada bem visível indica a presença da cumarina.

e) Alcaloides: Reativo de Mayer e Draggendorff.

0,1 g dos extratos foram dissolvidos em 5 mL de solução de ácido clorídrico a 5% e aqueceu-se por 10 minutos em banho maria (60º C). A solução foi distribuída em tubos de ensaio e então adicionadas 3 gotas dos reagentes de Dragendorff e Mayer. A presença de precipitados floculosos avermelhados e brancos respectivamente para cada reagente, indica a presença de alcaloides.

Resultados e Discussão

Rendimento dos extratos

Foram observadas taxas de rendimento que variaram entre 17,94 a 46,04% nos extratos analisados (Tabela 1), sendo o menor rendimento (17,94%) verificado no extrato bruto das cascas coletadas em ambiente natural, in situ. Constatou-se aumento no rendimento dos extratos oriundos do cultivo in vitro, independentemente do tipo de material vegetal, quando comparado com os extratos obtidos a partir de material cultivado em condições de campo (casa de vegetação) e coletados in situ. Estes resultados sugerem que a quantidade de metabólitos secundários produzidos in vitro são maiores que os obtidos em condições de campo e de ambiente natural, o que representa um fator positivo para produção de metabólitos de interesse, visto a quantidade de material vegetal demandado para produção dos mesmos.

O rendimento de extratos metanólicos [Metanol-água 4:1 (v/v)] de M. urundeuva oriundos de ambiente natural, obtido a partir do tronco da espécie procedente do cerrado do Triângulo Mineiro, foi relatado por QUEIROZ, MORAIS e NASCIMENTO (2002), onde foi encontrado rendimento de 18,07%. Enquanto BESSA et al. (2013), em estudos de prospecção fitoquímica com espécies de plantas medicinais nativas do cerrado, situado a 15 km do perímetro urbano de Gurupi, no sul do Estado do Tocantins, obtiveram rendimento de 12,4% em extrato etanólico de folhas de M. urundeuva. De acordo com RODRIGUES et al. (2011), o cálculo do rendimento de extratos vegetais é essencial no cultivo e obtenção da matéria prima vegetais pois, é fundamental no cultivo das espécies e poderá implicar na colheita e consequentemente na massa fresca necessária para obtenção do extrato, pois, seja pelo processo de secagem, como também determinado teor de compostos do bioativos no extrato, além de possibilitar uma redução das estimativas de custo e menor perda na cadeia produtiva de plantas medicinais e fitoterápicos

Tabela 1. Massas secas vegetais e rendimentos dos extratos metanólicos de Myracrodruon urundeuva Fr. All. obtidos a partir de: cascas e folhas coletadas em ambiente natural (casca in situ e folha in situ, respectivamente); folhas, caules e raízes de plantas cultivadas em casa de vegetação (folha campo, caule campo e raiz campo, respectivamente); folhas, caules e raízes de plantas cultivadas in vitro em tubos de ensaio (folha tubo, caule tubo e raiz tubo, respectivamente); folhas, caules e raízes de plantas cultivadas in vitro sob condições de co-cultivo (folha co-cultivo, caule co-cultivo e raiz co-cultivo, respectivamente) e brotos induzidos in vitro (brotos).

EXTRATOS MASSA SECA (mg)

RENDIMENTO (%)

casca in situ 82856,6 17,94 folha in situ 23260,6 30,83 folha campo 5703,1 32,80 folha Tubo 383,5 40,70

folha co-cultivo 235,2 34,57 caule campo 1661,6 18,22 caule tubo 316,0 46,04 caule co-cultivo 185,6 37,93 raiz campo 1465,5 18,07 raiz tubo 205,2 42,79 raiz co-cultivo 200,9 42,26 Brotos 209,6 45,04

Nesse sentido, o cultivo in vitro mostrou-se eficiente para redução da quantidade de material vegetal necessário para produção de metabólitos secundários, principalmente, quando se objetiva a produção de fitoterápicos em escala comercial, visto que, podem ser utilizadas quantidades inferiores de material vegetal, se comparadas com as demais formas de cultivo avaliadas, para a produção de concentrações semelhantes de metabólitos. Salientando ainda, que a extração de material vegetal em ambiente natural, como por exemplo a casca, pode levar a planta à morte, acentuando os problemas causados pela extração não sustentável da espécie, a qual contribuiu para que esta tenha sido, de acordo com o MMA (2008), listada como ameaçada de extinção.

Triagem fitoquímica qualitativa

A triagem fitoquímica dos extratos por CCD dos diferentes tipos de cultivos possibilitou detectar a presença de uma variedade de metabólitos secundários (Tabela 2). Ao analisar os resultados obtidos para esteroides/triterpenoides, observou-se o surgimento de manchas verdes ao borrifar-se a placa cromatográfica com o reagente de LiebermanBuchard, indicando a presença dessa classe química na maioria dos extratos, exceto em “caule tubo” e em todos os cultivos de raízes. Já para cumarina, os resultados demonstraram a ausência dessa classe química nos extratos de caule e raízes cultivadas em condições de campo, estando presente nos extratos analisados (Tabela 2).

Para detecção de compostos fenólicos/taninos a pulverização com cloreto férrico, apresentou resultado positivo (presença de coloração azul escuro) para todos os extratos vegetais. Enquanto não foi identificada a presença de alcaloides em nenhum dos extratos de M. urundeuva avaliados, não sendo observada mudança de coloração na placa cromatográfica ao ser borrifado o reagente de Dragendorff (Tabela 2).

Para os extratos advindos do material vegetal de ambiente natural, in situ, verificou-se que o teste de prospecção fitoquímica, através da Reação de Lieberman- Burchard para detecção de esteroides/triterpenóides, apresentou reação positiva (mudança de coloração para verde) para folha (Figura 1A) e negativa para casca (Figura 1B). Esses mesmos

extratos também apresentaram resultados positivos para presença de cumarina, os quais exibiram o aparecimento de manchas fluorescente após incidência de luz ultravioleta (Figura 2A) (Tabela 2).

Ao avaliar a presença de fenólicos/taninos através da prospecção fitoquímica observou-se mudança de coloração, indicando a presença desses fenóis com a adição da solução alcoólica de FeCl3 2% para os extratos obtidos tanto de folhas como de cascas coletadas em ambiente natural (Tabela 2). A presença de taninos foi evidenciada com a mudança de coloração para o marrom e aparecimento de precipitado através da reação com solução aquosa de FeCl3 3%, acetato de chumbo a 10% e acetato de cobre a 3% (Figura 2B) (Tabela 2). Esses resultados corroboram PEDROSO, SILVA e FURLAN (2009), em estudos com Porophyllum ruderale [Jaco.] Cass e Solidago sp., nos quais também foi verificado a presença de precipitados coloridos durante a identificação de taninos nessas espécies. No entanto, segundo os mesmos autores, apesar da verificação da formação de precipitados coloridos, indicando a presença de taninos condensados, há a necessidade de testes mais específicos para a confirmação ou não destes compostos bioativos nas espécies, uma vez que a época de colheita e o estágio vegetativo podem interferir nos resultados.

Tabela 2. Triagem fitoquímica (EST- esteróides/triterpenóides; CUM – Cumarinas; TAN – taninos; FENfenólicos/flavonóides; NIT – nitrogenados/alcalóides) qualitativa dos extratos vegetais de Myracrodruon urundeuva Fr. All. obtidos a partir de: cascas e folhas coletadas em ambiente natural (casca in situ e folha in situ, respectivamente); folhas, caules e raízes de plantas cultivadas em casa de vegetação (folha campo, caule campo e raiz campo, respectivamente); folhas, caules e raízes de plantas cultivadas in vitro em tubos de ensaio (folha tubo, caule tubo e raiz tubo, respectivamente); folhas, caules e raízes de plantas cultivadas in vitro sob condições de co-cultivo (folha co-cultivo, caule co-cultivo e raiz co-cultivo, respectivamente) e brotos induzidos in vitro (brotos).

EXTRATOS CLASSE QUÍMICA

EST CUM TAN FEN NIT

Casca in situ - + + + -

Folha in situ + + + + -

Folha campo + + + +Folha tubo + + + +Folha co-cultivo + + + + -

Caule campo + - + +Caule tubo - - + -Caule co-cultivo + - + + -

Raiz campo - - + +Raiz tubo - + + +Raiz co-cultivo - + + +Brotos + + + + -

Legenda: (+) Positivo; (-) Negativo

M. urundeuva tem sido relatada como uma espécie que apresenta altas concentrações de compostos fenólicos, especialmente os taninos (MONTEIRO et al., 2012). De acordo com TRENTIN et al. (2013), os taninos encontrados na espécie foram capazes de inibir a formação de biofilme (aglomerados de bactérias envolvidos por uma membrana) devido à sua capacidade de danificar membranas bacterianas, comprovando sua atividade bacteriostática.

A presença de flavonoides, com exceção do caule tubo, foi detectada em todos os extratos analisados (Tabela 2), através de reações de coloração positiva (reação de Shinoda e hidróxido de sódio). A Reação de Shinoda confirmou a presença dessa classe química apenas nos extratos de folha campo (Figura 3A), casca in situ e folha in situ, confirmadas pelo aparecimento da coloração de parda a vermelha. Nos demais extratos, a presença de flavonoides foi confirmada pela reação com NaOH, com exceção do caule tubo (Figura 3 B-S). De acordo com PEDROSO, SILVA e FURLAN (2009), o desenvolvimento de coloração nesta reação ocorre a partir da redução dos flavonoides em compostos antociânicos, com cor mais intensa. Enquanto, os reativos de hidróxido de sódio desenvolvem coloração pela reação com hidroxilas fenólicas, presentes na estrutura química dos flavonoides e, embora essas reações não sejam específicas para esses compostos, pois é possível encontrar nos vegetais outras substâncias fenólicas como os taninos e os antraderivados, por exemplo, elas são importantes como ensaios complementares para a caracterização da classe de flavonoide presente (PEDROSO; SILVA; FURLAN, 2009).

Os resultados obtidos nesse estudo estão de acordo com o descrito na literatura para a presença de flavonoides em M. urundeuva, como relata BESSA et al. (2013), em trabalhos de prospecção fitoquímica preliminar com a espécie, nos quais os autores identificaram a presença de flavonoides em extratos etanólicos obtidos a partir das folhas da aroeira-dosertão. Assim como MACHADO (2013), que em estudos de caraterização do extrato metanólico obtido a partir de folhas de M. urundeuva, também detectou a presença de flavonoides.

Os flavonoides são considerados um dos maiores grupos de metabólitos secundários das plantas, sendo encontrados amplamente em frutas, folhas, chás e vinhos (SILVA et al., 2015), sendo classificados em grupos diferentes, a exemplo de antocianinas, flavonas, flavonóis e as isoflavonas (TAIZ; ZEIGER, 2017). A utilização dos flavonoides como um potente agente profilático e terapêutico para muitas doenças tem sido crescente, abrangendo assim, seus efeitos como anti-inflamatório, antioxidante, antitumoral, antiviral, antiangiogênico, imunomodulador e antimicrobiano (SILVA, 2015). Nesse sentido, grande parte da atividade medicinal da aroeira-do-sertão pode estar

relacionada com a presença dessa classe química, contudo novos estudos como estes associado a isolamento químico seria necessário.

Figura 3. Reação de Shinoda e reação com NaOH para identificação de flavonoides. A- folha campo (reação de Shinoda); B- folha tubo (reação de Shinoda); C- folha tubo (reação com NaOH); D- folha co-cultivo (reação de Shinoda); E- folha co-cultivo (reação com NaOH); F- caule tubo (reação de Shinoda); G- caule campo (reação de Shinoda); H- caule campo (reação com NaOH); I- caule co-cultivo (reação de Shinoda); J- caule co-cultivo (reação com NaOH); L- raiz campo (reação de Shinoda); M- raiz campo (reação com NaOH); N- raiz tubo (reação de Shinoda); O- raiz tubo (reação com NaOH); P- raiz co-cultivo (reação de Shinoda); Q- raiz cocultivo (reação com NaOH); R- brotos (reação de Shinoda) e S- brotos (reação com NaOH) obtidos a partir de extratos de Myracrodruon urundeuva Fr. All. submetidos a diferentes condições de cultivo

Com exceção dos alcaloides, que não foram detectados em nenhum dos extratos analisados (Tabela 2), as diferentes classes de metabólitos secundários encontrados no presente estudo corroboram SILVA, MIRANDA e CONCEIÇÃO (2010), em trabalhos de prospecção fitoquímica com extratos etanólicos obtidos a partir das folhas e cascas de M. urundeuva coletadas na Área de Proteção Ambiental Municipal do Inhamum (Caxias/MA), nos quais foram detectadas a presença de esteroides/triterpenos e taninos nas folhas e alcaloides e saponinas (fraco positivo) tanto nas folhas, como na casca. Enquanto COLACITE (2015), em estudos fitoquímicos de Schinus terebinthifolia Raddi., Maytenus ilicifolia Reissek, Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan e Tabebuia avellanedae Lorentz ex Griseb. verificou a presença de taninos e alcaloides na composição de todos os extratos das plantas analisadas.

O screening fitoquímico dos extratos de M. urundeuva evidenciou que, independente do tipo de cultivo, mantêm o perfil fitoquímico geral (Tabelas 2 e 3). Esse resultado é de grande relevância, principalmente para interesses farmacêuticos que visam a produção dos metabólitos encontrados em M. urundeuva, e estimulam mais estudos visando a produção em larga escala da aroeira-do-sertão através de técnicas da cultura de tecidos vegetais, que representa uma alternativa sustentável para exploração da espécie.

Os diferentes órgãos vegetais diferiram entre si quanto a presença ou ausência de metabólitos para os esteroides, cumarinas e flavonoides. Essa diferença pode ser explicada pela própria característica dos metabólitos secundários, os quais geralmente são produzidos em diferentes regiões das plantas possuindo ainda, ação em região distinta de onde ocorre a produção. No entanto, o fato do extrato oriundo do caule cultivado no tubo e a raiz cultivada em campo terem apresentado resultado negativo para a presença de esteroides/triterpenoides, flavonoides e cumarinas, respectivamente (Tabelas 2 e 3), pode ter ocorrido por conta do próprio tipo de cultivo ou pela quantidade desse metabólito no extrato não ter sido suficiente para detecção através do método utilizado.

As características medicinais atribuídas à M. urundeuva ocorrem em virtude das diferentes classes de compostos químicos resultantes do metabolismo secundário vegetal, dentre esses estão os esteroides/triterpenoides e os compostos fenólicos cumarinas, taninos e flavonoides, cujas presenças foram detectadas em grande parte dos extratos analisados.

Conclusão

O perfil fitoquímico de M. urundeuva não foi alterado nas condições de cultivo avaliadas, existindo diferenças na produção de metabólitos entre os diferentes órgãos da espécie estudada.

O tipo de cultivo influencia no rendimento de extratos da espécie estudada.

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