UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

ESCUELA PROFESIONAL DE QUÍMICA

“Aislamiento de Hibalactona de las raíces de la

planta Hydrocotyle globiflora”

ALUMNO: AGUIRRE FLORES, IRVIN

DOCENTE: HERRERA HERNANDEZ, NORA

LIMA-PERÚ
2020
 INDICE

RESUMEN..................................................................................... ................................ 1
1. PROBLEMA................................................................................................................ 1
1.1. DESCRIPCIÓN O SITUACIÓN PROBLEMÁTICA……………….………………… 1
1.2. FORMULACIÓN………………………………………………………………...……… 1
1.2.1 PROBLEMA GENERAL……………………………………………..……………. 2
1.2.2 PROBLEMA ESPECÍFICO………………………………………………….……. 2
1.3. OBJETIVOS…………………………………………………………………………..… 2
1.3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………….….. 2
1.4. JUSTIFICACION……………………………………………………………………..… 2

2. MARCO TEÓRICO………………………………………………………………………… 3
2.1. ANTECEDENTES………………………………………………………………..…….. 3
2.1.1 ANTECEDENTE INTERNACIONAL……………………………………………… 3
2.2. BASES TEÓRICAS…………………………………………………………………….. 4
2.2.1 Hydrocotyle globiflora (Apiaceae)…………………………………….………….. 4
2.2.2 Hydrocotyle umbellata (Apiaceae)………………………………………..……… 4
2.2.3 Hibalactona………………………………………………………………….……… 5
2.3 HIPÓTESIS………………………………………………………………………..…….. 6
2.3.1 VARIABLES………………………………………………………………………… 6

3. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………………………………….…….. 7
3.1. REACTIVOS…………………………………………………………………….……… 7
3.2. MATERIALES…………………………………………………………………..……… 7
3.3. EQUIPOS…………………………………………………………………...…………. 7
3.4. FLUJOGRAMA DE INVESTIGACION………………………………………...……. 8
3.5. METODOLOGIA DE LA INVESTIGACION…………………………………………. 9
3.5.1 POBLACION……………………………………………………………….………. 9
3.5.2 MUESTRA………………………………………………………………..……….. 9
3.5.3 MUESTREO………………………………………………………………...……. 9
3.5.4 RECOLECCION DEL MATERIAL VEGETAL……………………………...…. 9
3.5.5 OBTENCION DEL EXTRACTO ETANOLICO………………………….…….. 9
3.5.6 FRACCIONAMIENTO Y AISLAMIENTO…………………………………...…. 9
3.5.7 ANÁLISIS MEDIANTE HPLC-PDA…………………………………………….. 10
3.5.8 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS………………………………..…….. 10
3.5.9 PREPARACIÓN DE LA SOLUCION ESTÁNDAR……………………….…… 10
3.5.10 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA………………………………………….. 10
3.5.11 VALIDACIÓN DEL MÉTODO HPLC-PDA……………………………….…… 10

4. POSIBLES RESULTADOS………………………………………………………………. 11

5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………………………………………. 12
Aislamiento de la molécula Hibalactona de las raíces
de la planta Hydrocotyle globiflora

RESUMEN

En este trabajo, validaremos un método para el aislamiento de la molécula

hibalactona en la planta Hydrocotyle globiflora, ya que, cuando estas moléculas
son aisladas, purificadas e identificadas, y su actividad biológica es probada y
pueden utilizarse en la medicina herbolaria tradicional o bien en la medicina
moderna para el consumo del ser humano, así como en la industria alimenticia
y la agricultura. El objetivo es determinar de qué manera se aísla la molécula
hibalactona de la planta Hydrocotyle globiflora, eso se determinaría gracias a
extractos de Hydrocotyle globiflora de sus partes subterráneas. En los
antecedentes nos basaremos en las investigaciones internacionales.

1. PROBLEMA
1.1 DESCRIPCIÓN O SITUACIÓN PROBLEMÁTICA

Actualmente existe diversas investigaciones extranjeras de la planta

Hydrocotyle umbellata pero, sin embargo, en el Perú tenemos la planta
Hydrocotyle globiflora en la cual no se ha hecho muchas investigaciones
científicas pero se sabe que esta planta posee similares propiedades por
pertenecer a la misma genero Hydrocotyle. Además, no conocemos el método
para la que demuestre ser selectivo, preciso y exacto siendo útil para el
aislamiento del lignano hibalactona

1.2 FORMULACIÓN

1.2.1. PROBLEMA GENERAL

 ¿Sera posible aislar la molécula hibalactona de la panta Hydrocotyle

globilora?
1.2.2. PROBLEMA ESPECÍFICO.
1
 ¿Cuáles son los métodos que existirán para determinar actividad
antiinflamatoria en la planta Hydrocotyle globilora?
 ¿Qué métodos serán empleados para identificar la hibalactona de la
planta Hydrocotyle globilora?

1.3. OBJETIVOS
 Aislar la molécula Hibalactona de la planta Hydrocotyle globiflora

1.3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Los métodos que se utilizaran son: maceración, extracción liquido-
liquido, C.C, TLC.
 Para la identificación se realizarán por el método IR, UV-VIS, RMN H1,
RMN C13, GS-MS, HPCL-PDA, etc.

1.4. JUSTIFICACION
Perú es uno de los pocos países que cuenta con una amplia despensa de
insumos naturales, capaces de prevenir males, aliviar todo tipo de dolencia e
incluso curar paulatinamente diversas enfermedades crónicas. Todos estos
productos, muchos provenientes de la Amazonía y región Andina Peruana,
sorprenden al mundo por los múltiples beneficios que brinda al organismo. Las
plantas medicinales peruanas son prueba de ello, varias han alcanzado una
alta demanda internacional por ser consideradas como nuevas alternativas
naturales para aliviar dolores o malestares que afectan la salud; sin embargo,
no existen estudios químicos reportados de la planta Hydrocotyle globiflora.
Por esta razón en el presente trabajo se llevará a cabo un estudio químico y su
evaluación de su actividad antiinflamatoria para su posible uso en el campo
medicinal, para luego formar un posible fitofármaco extraído de las raíces de la
planta Hydrocotyle globiflora por su actividad antiimflamatoria.
2. MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES
2
2.1.1 ANTECEDENTE INTERNACIONAL

De Oliveira y col en 2019, validaron por el método HPLC-PDA la cuantificación

de Hibalactona en Hidrocotyle umbellata para la cual hicieron una elusión
isocrática con acetonitrilo/metanol/agua (10:65:25). Finalmente, el método fue
selectivo, preciso y exacto.1
Silva y col en 2017, obtuvieron hibalactona de parte subterránea de
Hydrocotyle umbellata a partir de extracción con hexano, diclorometano,
acetato de etilo, agua y fraccionamiento por partición. La identificación se hizo
por espectroscopia RMN H1, RMN C13, espectrometría de masas y difracción
por rayos X. Se evaluó el efecto antiinflamatorio y ansiolítico. 2
Según Silva y col en 2017, el lignano hibalactona que es aislado de las raíces
de la planta Hydrocotyle umbellata el cual posee actividad antiinflamatoria y
antioxidante. Se realizaron estudios que involucra al anillo de butirolactona
utilizando enfoques de química electroquímica, espectrometría y
computacional.3
Según Hamdy y col en 2018, La planta Hydrocotyle umbellata L. se ha utilizado
en la medicina popular como hierba antiinflamatoria, ansiolítica y estimulante
de la memoria. Este estudio se centra en el estudio botánico características de
la hoja, el rizoma y las raíces, además de las huellas de ADN utilizando la
técnica de amplificación rápida (RAPD) e inter técnicas de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR) basadas en la repetición de secuencia simple (ISSR). 4
Según Hamdy y col en 2018, la planta Hydrocotyle umbellata L. utlizada en la
fitoterapia y medicina ayurvedica para mejorar la memoria; se estudio fue
designado para explorar la diversidad de los metabolitos bioactivos acumulados
que podrían explicar la potencial actividad de inhibición de la colinesterasa.
Además, el análisis del aceite volátil de las hojas y flores frescas usando
GC/MS mostró una composición similar. Los monoterpenos; α-pineno, β-
pineno, y limoneno representan los principales componentes del aceite. 5
De Oliveira en 2020, en planta Hydrocotyle umbellata se hicieron estudios de
control de calidad y determinar el contenido de fenoles totales, flavonoides
totales e hibalactona en las partes aéreas de la planta. El método CLAE
demostró ser selectiva, lineal y precisa para la cuantificación de Hibalactona. 6
Según Obaseki y col en 2016, investigaron las hojas de Hydrocotyle
bonariensis mediante el extracto hexanico para determinar la presencia y
concentración de fitoquimicos. Fue sometido a GS/MS y se validó su actividad
antiinflamatoria.7
De Wang y col en 2020, realizaron investigación a la planta Schefflera
leucantha mediante fitoquímica y farmacología el cual se pudieron aislar
diferentes compuestos, entre ellos se aislaron cuatro lignanos. Se utilizaron

3
métodos espectroscópicos para establecer la estructura y la configuración de
los aislados.8
Marcutillo y col en 2018, realizaron estudio del género Bursera el cual se
demostró que los fitoquímicos aislado de este genero son los terpenoides y los
lignanos.9

2.2. BASES TEÓRICAS

2.2.1 Hydrocotyle globiflora (Apiaceae)
Es una planta Endémica de Perú, propia de los lugares húmedos a 1000-2500
m. Hydrocotyle, consta de unas 75 especies con una distribución cosmopolita.
Para el Perú se citan 23 especies, de las que 8 son consideradas endémicas.
Tallos robustos, rastreros, moderadamente hirsutos; hojas no redondeadas,
reniformes de 8-13 cm. de diámetro, densamente hirsutuloso o hirsuto en los
nervios y venas, velloso en la parte inferior y superficialmente 12-14 lóbulos, el
lóbulo crenado, la cresta apical ligeramente más larga que la lateral, los
pecíolos son gruesos de 20-70 cm. largo, glabros por debajo e hirsuto por
arriba; los pedúnculos son más cortos que las hojas de 20-30 cm. largo.
Umbelas simples, de 80-150 flores; pedicelos de 5-20 mm. de largos, reflejos y
extendidos; fruta transversalmente elíptica, 1-1,5 mm. de largo, unos 2 mm. de
ancho, glabro, agudas y el estilopodio conspicuo, cónico. (Mildred E. Mathias,
1936, p.221)

2.2.2 Hydrocotyle umbellata (Apiaceae)

Hydrocotyle umbellata L., también conocido como acaricoba, es una especie
herbácea originaria del continente americano que crece principalmente en
suelos húmedos. Acaricoba es una planta con múltiples aplicaciones en los
campos de la fitorremediación acuática, cosmética y medicinal (Reis, 1992;
Sooknah y Wilkie, 2004; Rocha, 2011). Esta especie también es reconocida en
la medicina popular y ayurvédica (India). Debido a sus efectos ansiolíticos. Los
compuestos activos de Acaricoba reportados incluyen flavonoides, saponinas,
taninos, poliacetilenos, lignanos y aceites esenciales en hojas y partes
subterráneas (Martins, 2008; Oliveira., 2017).

Sus características físicas: Son plantas glabras; tallos delgados, flotantes o

trepadores; hojas orbiculares-peltadas de 5-75 mm. de diámetro, crenado o
crenadamente lobulado, los pecíolos en su mayoría delgados, 0,5-40 cm. largo;
pedúnculos generalmente más largos que las hojas de 1,5-35 cm. largo;
umbelas simples (rara vez con una ligera proliferación a lo largo del eje
principal), de muchas flores, los pedicelos de 2-25 mm. de largo. (Mildred E.
Mathias, 1936, p.207)
2.2.3 Hibalactona
La hibalactona, también conocida como savinina, es un lignano de 4
dibencilbutirolactona presente principalmente en especies de plantas leñosas
(Takaku et al., 2001). Además de la actividad con respecto a H. umbellata, la
hibalactona presenta un amplio espectro de actividades biológicas, como
propiedades insecticidas, actividad antimicrobiana, antiflamatoria, antitumoral,
antiestrogénica, anticolinesterásica y neuroprotectora.
Como Antinflamatorio: El lignano, hibalactona, se puede aislar de las raíces de
la planta. En la actividad antiinflamatoria y antioxidante de tales productos
naturales, se cree que el mecanismo de acción involucra al anillo de
butirolactona, que actuaría como farmacóforo libre. (Levi Thiago, 2017)

También algunos mecanismos de acción antiinflamatorios pueden estar

relacionados con la capacidad de prevenir procesos oxidativos. Teniendo en
cuenta, que el antioxidante y muchas otras propiedades biológicas de los
productos naturales tienen una fuerte conexión con su comportamiento redox,
la caracterización electroquímica puede ofrecer nuevos conocimientos en el
ámbito de ser o no un buen antiinflamante. Además, a pesar de la relevancia
farmacológica de la hibalactona.

Figura 1. Estructura química de Hibalactona

2.3 HIPÓTESIS 5

Se encontró el metabolito secundario Hibalactona en las raíces de la planta

Hydrocotyle globiflora

2.3.1 VARIABLES

 Variable dependiente: principio activo Hibalactona

 Variable independiente: raíz de la planta Hydrocotyle globiflora

6
3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 REACTIVOS
Hexano
diclorometano
acetato de etilo
metanol
CDCl3
acetonitrilo
agua filtrada

3.2 MATERIALES
Pera de decantación
Soporte universal
Vaso precipitado 50, 100, 250, 500 ml.
Papel aluminio
bagueta
Tijera para podar

3.3 EQUIPOS
Equipo ultravioleta
Espectrómetro Brüker Avance III
Dispositivo ultrasónico
Zorbax Eclipse XDB-C18

7
3.4 FLUJOGRAMA DE INVESTIGACION

Raíz de Hidrocotyle globiflora

Recolección, lavado, desinfectado, oreado y pulverizado

Maceración con 2L de ETOH x 4h “varias veces”

Extracto etanoico crudo

Disolver en MeOH/H2O (7:3)

Hexano

DCM
Extracción liquido-liquido
EtOAc

Se aislará x DCM la hibalactona

Identificación

RMN H1, RMN C13, HMBC, HSQC

Figura 2. Flujograma de investigación

3.5 METODOLOGIA DE LA INVESTIGACION
3.5.1 POBLACION 8

Las plantas Hydrocotyle globiflora Ruiz & Pav “sombrerito”, que crece en los
alrededores de la cuenca del rio Huallaga en el distrito de Santa María del Valle en
la provincia de Huánuco.  

3.5.2 MUESTRA
Se utilizara 2kg de la raíz del Hydrocotyle globiflora Ruiz & Pav “sombrerito”, que crece
en los alrededores de la cuenca del rio Huallaga en el distrito de Santa María del
Valle en la provincia de Huánuco.

3.5.3 MUESTREO
No probabilístico:
Criterio de inclusión: las raíces deben estar en buen estado, no rotas tampoco
maltratadas.
Criterio de excusión: raíces en mal estado.

3.5.4 RECOLECCION DEL MATERIAL VEGETAL

La recolección de la droga vegetal de la planta Hydrocotyle globiflora Ruiz & Pav
“sombrerito” se realizara en los alrededores de la cuenca del rio Huallaga en el distrito
de Santa María del Valle en la provincia de Huánuco. La cantidad de la droga vegetal
que se recolectará será de 2 kg, posteriormente serán lavadas, secadas en
temperatura de 40°C y finalmente molidas. El polvo se refrigerará a -6 ◦C y se
almacenará en contenedores capaces de proporcionar protección contra la humedad y
la luz.

3.5.5 OBTENCION DEL EXTRACTO ETANOLICO

El extracto etanólico se obtendrá por maceración con agitación, se empleará 400gr de
la droga vegetal seca que haya sido proporcionada en polvo (raíz de Hydrocotyle
globiflora Ruiz & Pav “sombrerito”) y se le añadirá 2 L de etanol al 95% (v/v) como
disolvente extractor por el tiempo de 4 horas. Para obtener un proceso extractivo
eficiente, la maceración se realizó más veces, obteniéndose así el extracto etanólico
crudo, que se concentrara en un rotavapor en 40 ◦C y después se almacenara en -6 ◦C
lejos de la luz. El extracto crudo (30 g) se disolverá en 250 ml de solución de metanol-
agua (7:3).

3.5.6 FRACCIONAMIENTO Y AISLAMIENTO

La mezcla fue sometida a partición líquido-líquido con disolventes de polaridad cada
vez mayor (es decir, hexano, DCM y EtOAc). La hibalactona se aisló de la fracción de
DCM (1,5 g), lo que dará 25 mg de sustancia pura. RMN 1H, RMN 13C, HMBC y
HSQC Se utilizaron datos espectrales para identificar el compuesto aislado.

 
3.5.7 ANÁLISIS MEDIANTE HPLC-PDA
9
El método analítico HPLC-PDA para la cuantificación de la hibalactona en los extractos
para identificar este marcador, variando la composición de la fase móvil
(acetonitrilo/metanol/agua) y los flujos que van de 0,5 a 1 ml min-1. Para evaluar las
condiciones de la prueba, se analizará un estándar de hibalactona (200 ug ml-1 en
metanol) y un extracto etanólico de las partes subterráneas de Hydrocotyle globiflora
Ruiz & Pav “sombrerito”. El volumen de la inyección fue de 10 uL y los experimentos
se realizaron por triplicado. Para la proposición de este método se emplearán las
condiciones que proporcionarán la mejor separación de hibalactona del extracto
etanólico de la planta.

3.5.8 CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS

El sistema de HPLC consiste en una Alianza de Aguas con un módulo de separación
e2695 y un detector de matriz de fotodiodos (PDA) 2998. La adquisición de datos se
realizará utilizando el software Empower (versión 2.0). Las separaciones
cromatográficas se llevarán a cabo utilizando una columna de fase inversa Zorbax
Eclipse XDB-C18 (250 × 4,6 mm, 5 um). La columna de temperatura se mantuvo como
25 ◦C y el volumen de inyección fue de 10 uL. Se obtuvo una separación satisfactoria
con una fase móvil isocrática con acetonitrilo/metanol/agua (10:65:25) a un flujo de 0,8
ml min-1. La longitud de onda de detección fue de 290 nm. Las fases móviles fueron
previamente filtradas a través de una membrana de PVDF de 0,45 um (Merck) y
desgasificadas utilizando un baño de ultrasonidos.

3.5.9 PREPARACIÓN DE LA SOLUCION ESTÁNDAR

Para preparar las soluciones estándar, 8.15 mg de hibalactona aislada se disolvieron
en metanol y luego se diluyeron a 10, 25, 50, 100, 150 y 200 ug ml -1. Antes de la
inyección en el sistema de HPLC, las soluciones fueron filtrados a través de una
membrana de PTFE de 0.45 um (Millex).

3.5.10 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Para evaluar el desarrollo y la validación del método, se extraerán por ultrasonido 2 g
de las partes subterráneas de Hydrocotyle globiflora Ruiz & Pav “sombrerito”, secadas
en polvo con 20 ml de etanol al 80% (v/v) durante 30 min en 25 ◦C. Antes de la
inyección en el sistema de HPLC, la solución se filtrará a través de una membrana de
PTFE de 0,45 um (Millex).

3.5.11 VALIDACIÓN DEL MÉTODO HPLC-PDA

El método se validará por el presente trabajo el cual incluirá una evaluación de los
siguientes parámetros: selectividad, linealidad, límite de detección y límite de
cuantificación, precisión, precisión y robustez.
4. POSIBLES RESULTADOS
Se esperará encontrar el metabolito secundario hibalactona de las raíces de la planta
Hydrocotyle globiflora Ruiz & Pav “sombrerito”) en el cual se ha evidencia que si se 10
encuentra en Hydrocotyle umbellata.
También se espera que el método por fraccionamiento de extracción liquido-liquido
sea muy eficiente para el aislamiento del principio activo de la Hydrocotyle globiflora.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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1. Oliveira M, Almeida P, Oliveira T, Silva L y col. HPLC-PDA method validated for

the determination of hibalactone in Hydrocotyle umbellata subterraneous parts
and its ultrasound-assisted extraction optimization. Revista Brasileira de
farmacognosia. 2018. Volumen 29. Disponible en: 10.1016/j.bjp.2018.10.003
2. Oliveira T, Ribeiro S, Oliveira M, Barreto V. Antinociceptive, anti-inflammatory
and anxiolytic-like effects of the ethanolic extract, fractions and Hibalactone
isolated from Hydrocotyle umbellata L. (Acariçoba) – Araliaceae. Biomedicine &
Pharmacotherapy. 2017. Volumen 95, pages 837-846. Disponible en:
10.1016/j.biopha.2017.08.140
3. Oliveira T, Siqueira K, Ribeiro S, Alves E y col. Electrochemical Behavior and
Antioxidant Activity of Hibalactone. International journal of electrochemical
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4. Hamdy S, Hefnawy H, Azzam S, Aboutabl E. Botanical and genetic
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Faculty of Pharmacy, Cairo University. 2018.Volumen 56, Pages 46-53.
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5. Hamdy S, Hefnawy H, Azzam S, Aboutabl E. Chemical profiling, volatile oil
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cultivated in Egypt. South African Journal of Botany. 2018. Volumen 115, pages
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6. Oliveria F. AVALIAÇÃO DO TEOR DE FENÓIS TOTAIS, FLAVONOIDES
TOTAIS E HIBALACTONA NAS PARTES AÉREAS DE Hydrocotyle umbellata
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https://doi.org/10.1016/j.bse.2020.104076
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and Pharmacological Review on Lignans from Mexican Bursera spp. molecules.
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